趙杰　呂潔麗　張濤　劉兆敏

摘 要 “天然藥物化學(xué)”是藥學(xué)專業(yè)中理論和實踐并重的專業(yè)基礎(chǔ)課。針對實驗課程教學(xué)現(xiàn)狀和不足，提出在教學(xué)過程中實施科研反哺教學(xué)，將科研精神用于教學(xué)，將科研成果引入課堂及開展實驗、科研課題等方式，以改進(jìn)“天然藥物化學(xué)”課程教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)學(xué)生綜合素質(zhì)。本文以冬凌草甲素的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定為例，進(jìn)行科研反哺教學(xué)的探索和實踐。

關(guān)鍵詞 天然藥物化學(xué) 科研反哺教學(xué) 冬凌草甲素

中圖分類號：G424? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2021.02.040

Practice of Research Feedback Teaching in Experimental Teaching

of Natural Medicinal Chemistry

——Take the extraction， isolation and structure identification of oridonin as an example

ZHAO Jie， LV Jieli， ZHANG Tao， LIU Zhaomin

（Sanquan Medical College， Xinxiang， Henan 453003）

Abstract "Natural medicinal chemistry" is a basic course which emphasizes both theory and practice in pharmacy. In view of the current situation and shortcomings of experimental teaching， this paper proposes to implement scientific research feedback teaching in the teaching process， apply scientific research spirit to teaching， introduce scientific research achievements into the classroom and carry out experiments and scientific research projects， so as to improve the teaching quality of natural medicinal chemistry and cultivate students' comprehensive quality. Taking the extraction， separation and structure identification of oridonin as an example， this paper explored and practiced the teaching of scientific research feedback.

Keywords natural medicinal chemistry; scientific research nurtures teaching; oridonin

天然藥物化學(xué)就是運用現(xiàn)代科學(xué)理論與方法研究天然藥物中化學(xué)成分的一門學(xué)科。其研究內(nèi)容包括天然產(chǎn)物中化學(xué)成分的提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定、理化性質(zhì)分析、生物合成途徑和生物活性研究等多個方面。天然藥物化學(xué)是一門實踐性很強(qiáng)的學(xué)科，實驗教學(xué)在天然藥物化學(xué)教學(xué)中占據(jù)著重要的地位。[1]

我們藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，針對天然藥物化學(xué)實驗教學(xué)中發(fā)現(xiàn)的問題，結(jié)合實驗教學(xué)內(nèi)容和教師的科研項目。本文以冬凌草甲素的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定為例，在教學(xué)過程中實施研究型教學(xué)，將科研方法和技術(shù)、科研成果滲入到天然藥物化學(xué)教學(xué)中。通過“科研反哺教學(xué)”創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式的實踐，不僅讓藥學(xué)專業(yè)的學(xué)生加深理解課本上抽象的理論知識，還可以掌握天然藥物中有效成分的提取、分離、精制與鑒定的基本方法和技能實驗操作，更重要的是提高和增強(qiáng)學(xué)生動手創(chuàng)新能力、動手能力和自學(xué)能力。[2]

1 實驗背景

冬凌草為唇形科香草菜屬多年生草本植物，產(chǎn)于河南太行山南麓。冬凌草具有清熱解毒、消炎止痛及抗腫瘤之功效?！吨袊撂禺a(chǎn)大全》《中華人民共和國藥典》分別將其收錄。[3]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明冬凌草的藥用成分主要是冬凌草甲素（oridonin），其結(jié)構(gòu)見圖 1。冬凌草甲素是具有中等極性的7，20-環(huán)氧型對映-貝殼杉烷類二萜化合物。1972年，中國食管癌研究中心，發(fā)現(xiàn)冬凌草具有獨特的抗食管癌，賁門癌、原發(fā)性肝癌功效，從此被廣泛應(yīng)用于臨床。[4]由于我省的冬凌草資源尤為豐富，近幾年來，我們學(xué)校天然藥物化學(xué)組多年一直致力于冬凌草和同屬香茶菜屬植物的化學(xué)成分及生物活性研究，發(fā)表了眾多的相關(guān)科研論文，[5-10]不僅為“天然藥物化學(xué)”理論和實驗教學(xué)提供了學(xué)術(shù)能力，也積極將科學(xué)研究優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為教學(xué)優(yōu)勢。

2 實驗方案的設(shè)計和安排

2.1 實驗方案的設(shè)計

學(xué)生文獻(xiàn)查閱，冬凌草甲素是中等極性的二萜類化合物，其D環(huán)具有 ， -不飽和環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)，從冬凌草中提取冬凌草甲素的方式主要是采用溶劑提取法，如：冷浸法，加熱回流法，以及超聲波輔助萃取法等。溶劑提取得到的浸膏分離提純冬凌草甲素的方法，主要有硅膠色譜柱分離法、大孔吸附樹脂分離法、活性炭回流法等。冬凌草甲素的結(jié)構(gòu)鑒定，主要以TLC 方法，與冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照。

2.2 儀器和試劑

儀器：層析柱（25mm？00mm），分液漏斗（500ml），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，圓底燒瓶（100ml、24#，2個;250ml，29#，1個），緩沖瓶（24#/29#），硅膠GF254薄層層析板，層析缸，電吹風(fēng)，滴管，量筒（100ml，10ml），臺秤，電爐，鑷子，紗布，脫脂棉，青霉素瓶。

試劑：柱層析硅膠（200-300目），5%濃H2SO4/無水乙醇溶液，冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品，乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮。

2.3 實驗步驟

2.3.1 提取

冷浸法：將粉碎后的200g冬凌草葉用70%丙酮/水1000ml室溫浸泡3天，共提取2次，合并2次提取液。將提取液減壓濃縮至無丙酮味，水液放置兩天使色素沉淀，過濾除去色素，濾液用乙酸乙酯150ml萃取1次，減壓濃縮乙酸乙酯萃取液至干燥起泡，得粉末狀浸膏。

超聲波輔助提取法：將粉碎后的200g冬凌草葉用70%丙酮/水1000ml在超聲波提取器提取2次，每次30min。將2次提取液減壓濃縮至無丙酮味，冷卻，水液放置兩天使色素沉淀，過濾除去色素，濾液用乙酸乙酯150ml萃取1次，減壓濃縮乙酸乙酯萃取液至干燥起泡，得粉末狀浸膏。

加熱回流法：將粉碎后的冬凌草葉200g用85%乙醇溶液500ml加熱回流2次，每次1h，將提取液減壓濃縮至干。浸膏加水溶解，水液放置兩天使色素沉淀，過濾除去色素。然后用乙酸乙酯150ml萃取1次，減壓濃縮乙酸乙酯萃取液至干燥起泡，得粉末狀浸膏。

2.3.2 柱層析分離

取上述粉末狀浸膏2.0g，用甲醇完全溶解，3.0g硅膠拌樣，干燥后，干法上柱，上柱用硅膠40g。用氯仿/甲醇（20：1）洗脫，每次流分體積為50ml，收集總流分體積約300ml時，冬凌草甲素被洗脫下來，減壓濃縮析晶，可得無色晶體。

2.3.3 重結(jié)晶

用丙酮可純化出冬凌草甲素。

2.3.4 TLC鑒定

樣品：冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品。

展開劑：氯仿/甲醇（10：1）溶液。

TLC薄層用5%濃H2SO4/無水乙醇顯色，與標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行鑒定。

2.4 ?實驗結(jié)果與討論

冬凌草因其入藥部位為全草，溶劑提取液中含有大量葉綠素，對冬凌草甲素的提取和分離造成了困難。學(xué)生參考了大量的文獻(xiàn)后，設(shè)計了三種可行的冬凌草甲素的提取方案，分別70%丙酮/水室溫浸泡提取，該方法在提取過程中，可過濾除去大量的葉綠素，有利于后續(xù)的純化分離。冷浸法有助于提取對高溫下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的化合物，提取率高，但提取時間較長。我們同樣用70%丙酮超聲輔助提取法，該法縮短了提取的時間、提取液中雜質(zhì)和色素較少。目前廣泛使用乙醇熱回流法，該法提取物中極性范圍廣，雜質(zhì)較多，色素中，增加后續(xù)分離難度。

針對色素去除方法，有用石油醚去除色素，脫色效率低;采用活性炭脫色效果好，但容易造成冬凌草甲素的產(chǎn)率下降。我們采用柱色譜的方法，該法簡單直接。根據(jù)冬凌草甲素的理化性質(zhì)，學(xué)生設(shè)計了三種不同的冬凌草甲素的提取方法，根據(jù)實驗結(jié)構(gòu)的比較分析，不僅能讓學(xué)生加深天然化合物的多種提取分離方法，還增強(qiáng)他們的動手能力和獨立思考能力。

3 結(jié)論

冬凌草甲素作為一種副作用小的防癌抗癌藥物，在國際國內(nèi)市場需求量很大。因此冬凌草甲素的提取分離和活性研究尤為重要。我們天然藥物化學(xué)組一直致力于冬凌草及其相關(guān)屬植物的化學(xué)成分研究，我們將典型的冬凌草甲素的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定引入到“天然藥物化學(xué)”實驗教學(xué)過程中。學(xué)生根據(jù)實驗要求親自參與設(shè)計實驗方案，結(jié)合文獻(xiàn)設(shè)計了三種冬凌草甲素的提取分離方法，并驗證了方案可行性?？蒲蟹床附虒W(xué)的實踐可以調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)積極性，培養(yǎng)實驗操作能力強(qiáng)的學(xué)生，使其今后能勝任工作崗位和為祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥事業(yè)做貢獻(xiàn)的需求。

項目基金：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院教育教學(xué)改革研究項目，編號2017-XYJG-32

參考文獻(xiàn)

[1] 呂潔麗，張來賓，白素平，等.線上線下多元化教學(xué)模式在天然藥物化學(xué)教學(xué)改革中的應(yīng)用[J].藥學(xué)教育，2019，35（3）：41-44.

[2] 尚麗平.淺談教學(xué)與科研的關(guān)系[J].西南科技大學(xué)高教研究，2007，82（1）：15-16.

[3] 河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，河南醫(yī)學(xué)院，云南植物研究所，一種新的抗腫瘤物質(zhì)——冬凌草素[J].科學(xué)通報，1978，23（1）：122.

[4] 孫漢董，許云龍，姜北.香茶菜屬植物二萜化合物[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[5] HouRJ，Yan FL，ZhangHY，BaiYX，DingMM，Two new diterpenoids and other constituents from Isodonrubescens[J].Fitoterapia，2011，（82）4：726-730.

[6] 尚校軍，董若怡，馬素英，等.冬凌草甲素固體分散體的制備及溶解性能研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27 （5）：418-421.

[7] Yan FL，GuoLQ，WangCM，et al.Chemical constituents of Isodonnervosus and their cytotoxicity[J].Journal of Asian natural products research，2009，11（4）：326-331.

[8] 袁永亮.河南狹苞橐吾和冬凌草化學(xué)成分及生物活性研究[D].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，2009.

[9] 謝瑞杰.冬凌草和溪黃草化學(xué)成分及生物活性研究[D].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，2008.

[10] Yan FL，Wang CM，Guo LQ，et al. A new ent-kauranediterpenoid from Isodonnervosus[J].Journal of Chemical Research，2008，（9）：522-524.