畢付提，史亞楠，張久祎，王靜然，薛鮮麗，2，王德培，2*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；3.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

米曲霉作為食品安全菌種，廣泛應用于發(fā)酵食品如生產(chǎn)米酒、醬油等。同時由于其能分泌大量的酶，也用于淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、脂肪酶等多種酶制劑的生產(chǎn)。近年來通過基因改造，米曲霉還用于生產(chǎn)多種有機酸如蘋果酸、曲酸等。由于米曲霉獨特的代謝特征可產(chǎn)生多種被人類所需要的產(chǎn)品，已成為絲狀真菌中的重要研究對象。

傳統(tǒng)針對米曲霉的改良，一般是通過誘變的方法進行。隨著分子生物學技術的發(fā)展，希望能有效地、有目的性地對米曲霉代謝產(chǎn)物相關基因進行針對性改造以獲得更好的生產(chǎn)性能。抗性篩選是基因改造過程中必不可少的途徑，但米曲霉自身具有較高的耐藥性，很少有外源抗性標記可直接用于米曲霉的改造[1]。據(jù)報道潮霉素抗性標記hyg[2-3]，博來霉素抗性標記ble[4]曾成功用于米曲霉真菌遺傳轉化，但是需要額外加輔助劑氯丙嗪和曲拉通來增加菌株敏感性。即便加入輔助劑，其對潮霉素抗性達到600 μg/mL，導致篩選過程假陽性率極高。此外，成功用于米曲霉遺傳轉化的抗性標記還有吡啶硫胺素[5-6]、萎銹靈[7]、腐草霉素[8]，但使用濃度也高于一般絲狀真菌如黑曲霉，而這些抗性標記轉化篩選系統(tǒng)所需抗生素價格昂貴，這限制了其在米曲霉基因操作中的應用。

營養(yǎng)缺陷型篩選標記可通過將相應的營養(yǎng)缺陷基因回補進行轉化子篩選。常用的營養(yǎng)缺陷型有尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型[9-10]，亞硝酸鹽營養(yǎng)缺陷型[11-12]等。絲狀真菌尿嘧啶核苷酸合成過程有兩個關鍵酶，其中一個是pyrF基因編碼乳清苷酸焦磷酸化酶，催化乳清酸到乳清苷酸這一步反應；另一個是pyrG基因編碼的乳清酸核苷-5′-磷酸（orotidine-5′-monophosphate，OMP）脫羧酶，催化乳清苷酸到尿嘧啶核苷酸最后這一步反應。pyrF或者pyrG任一基因的突變或缺失都將導致尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的產(chǎn)生，而將相應回補基因轉入突變株可恢復為原養(yǎng)型。尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株必須在額外補充尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基上才能正常生長，而野生型菌株會把5-氟乳清酸（5-fluoroorotic acid，5-FOA）轉化為致死的5-氟尿嘧啶因而不能在含5-FOA的培養(yǎng)基生長[13]。利用這個特性，一方面可以通過5-FOA篩選獲得尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，另一方面可以用不加尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基篩選回補原養(yǎng)型菌株。目前，成功獲得尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的途徑有多種，例如由孢子經(jīng)紫外誘變后置于添加5-FOA的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)[14]，或將野生型米曲霉孢子直接涂布在5-FOA平板上，適宜條件下均可獲得少量營養(yǎng)缺陷型菌株[15]。然而隨機突變獲得的尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株可能是pyrG突變，也可能是pyrF突變，這增加了尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)回補問題的復雜性[15-16]。

本研究以米曲霉3.042為出發(fā)菌株，首先擴增米曲霉3.042的pyrG基因，并進行序列分析。嘗試分別以紫外誘變法和左右臂同源重組法破壞米曲霉自身的pyrG基因獲得尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，并驗證缺陷型菌株的基因型。最后以米曲霉3.042自身來源的pyrG基因作為遺傳標記回補相應營養(yǎng)缺陷型菌株，并成功獲得回補為原養(yǎng)型的突變菌株。本研究為米曲霉3.042無抗性標記的遺傳改造提供有效的篩選標記。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌種和培養(yǎng)基

葡萄糖、NaNO3、K2HPO4、FeSO4、KCl、MgSO4·7H2O、瓊脂粉（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；5-氟乳清酸、尿苷、尿嘧啶、曲拉通X-100、頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素、卡那霉素（均為分析純）：北京市索來寶科技有限公司；DL5000 DNA Maker、快速DNA聚合酶（5 U/μL）：南京諾唯贊生物科技有限公司；T4-DNA連接酶（10 U/μL）、高保真 DNA 聚合酶（2.5 U/μL）、限制性內切酶 EcoRI（15 U/μL）、HindⅢ（15 U/μL）：寶日醫(yī)生物技術有限公司。

米曲霉3.042（米曲霉CGMCC 3.00951）、大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌AGL1：中國普通微生物菌株保藏管理中心，由天津科技大學生物工程學院生化過程與技術研究室保藏。

篩選培養(yǎng)基以CD培養(yǎng)基（配方：葡萄糖2%、NaNO30.2%、K2HPO40.1%、FeSO40.01%、KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、瓊脂2%）添加0.007%曲拉通X-100，0.1%尿苷、0.1%尿嘧啶、0.2%5-FOA，篩選驗證尿苷/尿嘧啶缺陷型突變株；用PDA培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)米曲霉6 d獲得新鮮成熟孢子用于誘變或基因轉化；以CM培養(yǎng)基添加0.1%尿苷和0.1%尿嘧啶傳代驗證突變株遺傳穩(wěn)定性；以CM培養(yǎng)基作為pyrG回補菌株的篩選培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基參照文獻[17]配制；農(nóng)桿菌轉化所用IM培養(yǎng)基參照文獻[10]配制。

1.2 儀器與設備

Mandela型多功能等離子體誘變系統(tǒng)：北京艾德豪克儀器生物有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；WXL-A30002電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ChampGel5000全自動凝膠成像儀：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；Eppendorf PCR儀：上海恒久醫(yī)療器械有限公司。

1.3 紫外誘變法獲得尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變株

將PDA斜面生長6 d的孢子用生理鹽水清洗，于30℃、180 r/min下孵育5 h，調整孢子濃度為107個/mL。取200 mL孢子懸液于20 W，25 mm紫外照射誘變120 s。誘變結束后立即置于黑暗處靜置2 h～3 h，并涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃黑暗培養(yǎng)3 d～5 d。待長出的轉化子開始產(chǎn)孢，即挑取孢子分別點種在加尿苷/尿嘧啶的CM培養(yǎng)基和普通CM培養(yǎng)基再次驗證。提取僅能在加尿苷/尿嘧啶培養(yǎng)基上正常生長的突變菌株基因組進行聚合酶鏈式反應驗證pyrG基因，然后送到華大基因測序進一步驗證，并繼續(xù)用兩種培養(yǎng)基傳10代驗證突變株穩(wěn)定性。

1.4 pyrG敲除質粒pk5的獲取

pk5質粒的構建：以p44為出發(fā)質粒，米曲霉3.042基因組為模板擴增所需片段。根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的米曲霉RIB40乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因（pyrG）序列（AO090011000868）設計上下游引物，以米曲霉3.042基因組為模板擴增pyrG基因并送至華大測序。pyrG基因包括834 bp的CDS區(qū)和65 bp內含子。首先以F0和R0引物擴增pyrG基因片段并送至華大基因測序。以1-F和1-R引物，2-F和2-R引物分別擴增得到pyrG左側上游同源臂pyrGL和pyrG右側下游同源臂pyrGR。用1-F和1-R引物將兩同源臂片段融合成一個片段pyrGLR。將p44質粒和片段pyrGLR用EcoRI和HindⅢ雙酶切，連接獲得質粒pk5，并化轉至大腸桿菌。以大腸桿菌菌液為模板驗證pk5質粒敲除框全長。pk5質粒用于同源重組敲除米曲霉pyrG基因。本研究所用引物均由金唯智生物科技公司合成，如表1所示。

表1 試驗中用到引物Table 1 The primers used in the test

1.5 農(nóng)桿菌侵染獲得米曲霉營養(yǎng)缺陷型轉化子

將pk5質粒電轉化農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細胞，并以菌液為模板驗證農(nóng)桿菌。按照文獻所述方法孵育農(nóng)桿菌[18]，之后將農(nóng)桿菌與米曲霉新鮮孢子置于IM固體培養(yǎng)基硝酸纖維膜上，25℃避光共培養(yǎng)48h。待共培養(yǎng)過后用無菌生理鹽水將米曲霉孢子從膜上洗到添加100 μg/mL的氨芐青霉素和250 μg/mL頭孢噻肟鈉的篩選培養(yǎng)基1，30℃黑暗培養(yǎng)5 d～7 d。其它步驟同1.3。

1.6 轉化子的恢復突變

將遺傳穩(wěn)定的營養(yǎng)缺陷型突變株作為出發(fā)菌株，用農(nóng)桿菌介導的轉化法，將攜帶pyrG回補標記基因的質粒pk1轉化整合到尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株基因組上。農(nóng)桿菌和孢子共培養(yǎng)后，洗至添加100 μg/mL的氨芐青霉素和250 μg/mL頭孢噻肟鈉的CM平板初篩，30℃培養(yǎng)2 d～3 d。初篩板長出單菌落孢子分別點種至CM培養(yǎng)基復篩板和5-FOA平板，30℃培養(yǎng)2 d～3 d至產(chǎn)孢，選擇在CM培養(yǎng)基正常生長而5-FOA平板上不能生長的菌株驗證pk1表達框全長，及其pyrG基因。

2 結果與討論

2.1 米曲霉3.042 pyrG序列擴增及比對

將pyrG測序結果與米曲霉RIB40 pyrG編碼氨基酸比對，序列一致性為99.64%，存在堿基差異?？紤]米曲霉3.042可以在CM培養(yǎng)基中正常生長，推測其pyrG的突變位點不影響乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶正常表達。

為了進一步研究pyrG的絲狀真菌親緣關系，對來自不同絲狀真菌的pyrG基因編碼氨基酸進行進化樹分析，如圖1所示。

圖1 米曲霉3.042 pyrG編碼氨基酸及其同源蛋白的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of pyrG from A.oryzae 3.042 with other homologs

幾種米曲霉菌株pyrG編碼氨基酸序列一致性最高，與其它曲霉屬差異明顯，與酵母菌差異顯著。

2.2 誘變獲得的尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株驗證

以誘變獲得的兩株穩(wěn)定的尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型米曲霉O2、O11的基因組擴增pyrG，均能擴增成功。各突變菌株pyrG編碼氨基酸比對如圖2所示，兩突變株pyrG基因編碼氨基酸3’端有多個缺失，選擇米曲霉O11作為出發(fā)菌株回補pyrG。

2.3 pyrG敲除質粒pk5的構建

質粒pk5的構建見圖3。

圖2 米曲霉突變株pyrG編碼氨基酸比對（總體一致性96.87%）Fig.2 Sequence alignment of pyrG amino acids encoded by A.oryzae mutants（96.87% overall identity）

圖3 質粒pk5的構建Fig.3 Plasmid construction of pk5

如圖3a所示，pyrG基因上下游同源臂均成功擴增。如圖3b所示，將p44質粒和pyrGLR片段用EcoRI、HindⅢ成功雙酶切。連接p44質粒、pyrGLR片段以獲得pk5質粒，驗證如圖3c所示。其中3號泳道為陽性轉化子，表明pk5質粒構建成功。pk5農(nóng)桿菌驗證如圖3e所示，由于pk5質粒不含完整pyrG基因，只能擴增出不足500 bp殘余片段。

pyrG基因敲除后獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株可用pyrG基因作為選擇標記直接進行后續(xù)的分子改造。以分子改造獲得尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株較誘變獲得的營養(yǎng)缺陷菌株主要有兩個優(yōu)點：一是pyrG基因編碼區(qū)的大片段敲除盡可能避免自發(fā)恢復突變；二是缺陷型菌株基因型確定，可直接以pyrG基因回補而不必再鑒定出發(fā)菌株基因型是pyrG突變還是pyrF突變。

2.4 同源重組法獲取尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型轉化子及驗證

pk5轉化子的驗證見圖4。

圖4 pk5轉化子的驗證Fig.4 Transformants verification of pk5

如圖4a所示，pk5質粒上的pyrG同源臂同源重組替換米曲霉的pyrG基因，即獲得敲除pyrG的米曲霉突變株。如圖4b所示，正確的轉化子才能在添加5-FOA的培養(yǎng)上生長。以引物1-F和2-R PCR驗證轉化子基因型，由圖4c可知，3號泳道80號轉化子有pk5表達框全長陽性條帶和基因組陰性條帶，為隨機插入轉化子。4、5、6 號泳道米曲霉 g-1、g-5、g-6 均有唯一pk5表達框全長插入，為正確轉化子。由圖4d進一步驗證可知，米曲霉g-1 pyrG已被敲除。傳10代驗證米曲霉g-1遺傳穩(wěn)定，因此以米曲霉g-1為出發(fā)菌株進行后續(xù)pyrG回補試驗。

2.5 營養(yǎng)缺陷型菌株的回補試驗

尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型米曲霉突變株的pyrG回補驗證見圖5。

2.5.1 誘變來源營養(yǎng)缺陷型菌株的pyrG回補

以米曲霉O11為出發(fā)菌株的pk1質粒轉化回補pyrG試驗共進行4次，但是未能獲得pyrG插入的回補轉化子。如圖5a部分轉化子驗證所示，均無pk1表達框的插入。這說明誘變得來的營養(yǎng)缺陷型轉化子米曲霉O11即使傳代驗證穩(wěn)定后用于共培養(yǎng)轉化，表型仍然不穩(wěn)定。另外誘變獲得的米曲霉O11也可能不只是pyrG突變，還可能是pyrF等其它相關基因的突變導致的尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷表型。如果是其它基因的突變，即使成功回補pyrG，米曲霉O11也無法恢復為野生型表型。將米曲霉3.042、米曲霉O11 pyrG測序結果編碼的氨基酸序列于Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白三維結構預測，結果分別如圖5b、5c所示?？梢娒浊筄11編碼氨基酸的變化未導致乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶三維結構的明顯變化，因此pyrG 3’端的部分缺失可能無法引起乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶活力完全喪失。

圖5 pk1轉化子驗證Fig.5 Transformants verification of pk1

2.5.2 同源重組轉化獲得營養(yǎng)缺陷型菌株的pyrG回補

以米曲霉g-1為出發(fā)菌株的pk1質粒根癌農(nóng)桿菌轉化共進行3次，復篩板共計獲得轉化子96個，其中8個為隨機插入轉化子，占比8.33%。部分轉化子驗證pk1表達框如圖5e所示，轉化子不穩(wěn)定可能是米曲霉孢子多核導致的。米曲霉產(chǎn)生的孢子大部分都是多核的，如米曲霉RIB40雙核及以上多核孢子占總孢子數(shù)70%以上[19]。在發(fā)酵過程中形成多核分生孢子有助于米曲霉環(huán)境適應性，但這不利于菌種誘變篩選和基因操作。需要特別注意是以米曲霉g-1為出發(fā)菌株轉化，復篩后表型為原養(yǎng)型的轉化子大都是假陽性，即沒有pk1全長插入。這一方面可能是轉化子僅隨機插入包含pyrG回補標記的部分片段，另一方面可能還是由于出發(fā)菌株的自發(fā)恢復突變。

由上述pyrG回補結果可見，從米曲霉3.042基因組擴增得到的pyrG回補標記可用于pyrG型尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型米曲霉恢復突變。同時證明米曲霉g-1為穩(wěn)定的pyrG基因缺陷型，可直接用于基因轉化。最終未能獲得同源重組敲除msn2基因的轉化子，表明pk1質粒轉化存在諸多問題如：轉化效率較低，全長隨機插入轉化效率僅為8.33%；篩選板上假陽性率過高。分析原因一方面可能是pk1質粒msn2同源臂長度、位置設置不合理導致轉化效率低，另一方面可能是CM培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，其酵母粉中含少量尿苷、尿嘧啶，作為初篩平板不恰當，導致了大量假陽性。因此可以考慮使用CD培養(yǎng)基初篩。

3 結論

本研究表明誘變獲得的米曲霉營養(yǎng)缺陷型菌株基因型復雜，難以直接作為出發(fā)菌株進行基因回補改造。誘變獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株可能需要經(jīng)過復雜的驗證，才能用于后續(xù)改造。另外誘變過程是否對菌株其它代謝基因有所破壞也很難驗證，因此誘變并不是一種高效獲得營養(yǎng)缺陷型的方法。

本研究以標準米曲霉3.042為出發(fā)菌株，農(nóng)桿菌介導的轉化法破壞米曲霉3.042的pyrG基因，獲得性狀穩(wěn)定的尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型米曲霉g-1。之后將包含米曲霉3.042野生型自身pyrG回補基因的質粒pk1成功轉化到尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株g-1中，證實米曲霉3.042 pyrG基因的回補可恢復相應缺陷型菌株為野生型。本研究充分驗證米曲霉3.042自身pyrG基因可作為篩選標記直接進行基因改造，并實現(xiàn)以此為標記的基因操作。本試驗初步建立米曲霉3.042 pyrG敲除回補標記轉化體系，為之后工業(yè)米曲霉分子改造提供基礎。