鮑大鵬 萬佳寧 盧緒志 余養(yǎng)朝 張光忠 茅文俊王 瑩 周陳力

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點實驗室/國家食用菌工程技術(shù)研究中心/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海 201403;2江蘇華綠生物科技股份有限公司,江蘇 泗陽 223700)

金針菇[Flammulina velutipes(Fr.)Singer.]是一種重要的栽培食用菌,因其味道鮮美,口感脆嫩滑爽,且具有較高的營養(yǎng)價值、藥用價值,深受廣大消費者青睞,市場前景較好[1-2]。金針菇栽培產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展依賴優(yōu)良菌種。金針菇菌種通常以無性繁殖方式進行復(fù)制,而優(yōu)良菌種的選育需要投入大量的人力、物力和時間成本[3-4]。因此對金針菇菌種的開發(fā)與研究具有重要意義。

營養(yǎng)缺陷型菌株是指經(jīng)過人工誘變或自然突變喪失了合成某種營養(yǎng)物質(zhì)能力的菌株,其在基本培養(yǎng)基中無法正常生長,只能在完全培養(yǎng)基或者在補充特定營養(yǎng)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基上才可以正常生長[5]。目前在真菌中已報道的營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選標(biāo)記有腺嘌呤[6]、組氨酸[7]、亮氨酸[8]、蛋氨酸[9]、尿嘧啶[10]、色氨酸[11]、核菌素[12]、精氨酸[13]、肌醇[14]、脯氨酸[15]等。尿嘧啶是常見的篩選標(biāo)記,且尿嘧啶合成代謝路徑中的關(guān)鍵酶編碼基因pyrG已經(jīng)被成功克隆;pyrG編碼的乳清苷-5′-磷酸脫羧酶(orotidine-5′-phosphate decarboxylase,OMPDC)能夠催化真菌中尿嘧啶合成途徑的最后一步酶反應(yīng),通過脫羧作用催化乳清酸核苷酸轉(zhuǎn)化為尿苷酸[16-17]。5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid,5-FOA)是尿嘧啶合成途徑中乳清酸核苷酸的底物類似物,能夠被pyrG基因編碼的酶轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶核苷酸,該物質(zhì)有很強的細(xì)胞毒性能夠抑制野生型菌株的生長[18]。pyrG基因發(fā)生突變后可以使?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株喪失合成OMPDC 的能力,不能代謝有毒的5-氟尿嘧啶核苷酸,從而獲得5-FOA 抗性[19]。目前金針菇的全基因組測序已經(jīng)完成,這為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的分子鑒定和分子標(biāo)記提供了基礎(chǔ)[20]。

盧緒志等[21]通過紫外誘變成功獲得了金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體菌株,該菌株在不含尿嘧啶的基本培養(yǎng)基中無法正常生長。本研究在此基礎(chǔ)上運用雜交方法培育出尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的金針菇雙核體菌株,旨在建立一種可以用于鑒別、標(biāo)記菌種的方法,為金針菇菌種分子遺傳學(xué)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體菌株NG1-65、NG1-92 和NG1-95(交配型均為A1B1)由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遺傳工程實驗室獲得并保存。野生型單核體菌株DG1-29(交配型為A2B2)由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遺傳工程實驗室從金針菇野生型雙核體菌株G1 菌株分離得到,G1 由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作和配方 1)馬鈴薯培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):PDA 粉末(美國BD 公司)39 g,加水至1 L,滅菌,倒平板,供菌絲活化與菌絲培養(yǎng)使用。

2)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB):PDB 粉末(美國BD 公司)24 g,加水至1 L,滅菌后用來培養(yǎng)菌絲。

3)尿嘧啶馬鈴薯培養(yǎng)基(potato dextrose agar add uracil,PDAU):在PDA 培養(yǎng)基中添加0.05 mmol·L-1的尿嘧啶(美國SIGMA 公司)。

4)篩選培養(yǎng)基(potato dextrose agar add uracil and 5-FOA,PDAUF):在PDA 培養(yǎng)基中添加0.05 mmol·L-1的尿嘧啶及0.5 g·L-15′-氟-乳清酸[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

5)基本培養(yǎng)基(minimal midium,MM):20 g 葡萄糖、1.0 g KH2PO4、1.5 g(NH4)2HPO4、0.3 g MgSO4·7H2O、500 μg Thiamine HCL、15 g 瓊脂粉、加水至1 L,滅菌后倒平板備用。

6)尿嘧啶基本培養(yǎng)基(minimal medium add urail,MMU):在基本培養(yǎng)基中添加0.05 mmol·L-1尿嘧啶。

7)篩選培養(yǎng)基(minimal medium add uracil and 5-FOA,MMUF):在基本培養(yǎng)基中添加0.05 mmol·L-1尿嘧啶及0.5 g·L-15′-氟-乳清酸。

1.2.2 親本的選擇 將金針菇營養(yǎng)缺陷型菌株NG1-65、NG1-92、NG1-95 分別與金針菇單核體菌株DG1-29 進行雜交后得到3 株雙核體菌株SGN1、SGN2、SGN3(交配型均為A1B1+A2B2)并進行出菇試驗。

1.2.3 金針菇的單孢分離及單核菌絲群體的建立 雙核體菌株SGN1、SGN2、SGN3 出菇后選擇菇形完整、無病蟲害的新鮮子實體于無菌環(huán)境下收集自然彈射的孢子。將收集到的孢子放入裝有無菌水的EP 管中制備孢子懸液,血球計數(shù)板計數(shù)后再用無菌水稀釋至104·mL-1個單孢子[22]。取100 μL 孢子液涂布到PDAUF 培養(yǎng)基上,于25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng),一般7 d 內(nèi)可見到孢子萌發(fā)的菌絲體。將孢子萌發(fā)的菌絲體轉(zhuǎn)接到PDAU 培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5 d 后再挑邊緣菌絲體于新的PDAU 培養(yǎng)基上,重復(fù)5 次后[23]置于顯微鏡(Zeiss Axio lab A1 正立顯微鏡,德國)上檢查,挑出無鎖狀聯(lián)合的菌絲體備用,淘汰有鎖狀聯(lián)合的菌絲體。

1.2.4 尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢子的選擇 將無鎖狀聯(lián)合的菌絲體分別接種于MM、MMU、MMUF 培養(yǎng)基上。挑選出能在MMU 和MMUF 培養(yǎng)基上生長但在MM 上不生長的單孢子萌發(fā)的菌絲體,即為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢萌發(fā)菌株。

1.2.5 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢子的交配 將尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢萌發(fā)菌株配對在MMU 培養(yǎng)基上進行雜交。雜交菌絲融合后,挑出融合處菌絲進行鏡檢,有鎖狀聯(lián)合的為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株。

1.2.6 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體菌株的5-FOA 驗證 將金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株繼代5 次后,分別接種于MM、MMU、MMUF 培養(yǎng)基上,觀察其生長情況。

1.2.7 尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株基因組DNA 的提取與分子標(biāo)記驗證 采用CTAB 法[24]提取金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體菌株基因組DNA。根據(jù)金針菇pyrG(GenBank:KY401432)基因設(shè)計分子標(biāo)記引物(表1)。PCR 擴增體系為50 μL,包含:TaKaRa ExTaq(5 U·μL-1)0.5 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL,模板DNA(100 ng·μL-1)1 μL,正反向引物各1 μL,雙蒸水(ddH2O)37.5 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸2 min,30～35 個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存?zhèn)溆?。對PCR 產(chǎn)物進行切膠回收后,用限制性內(nèi)切酶于37℃水浴酶切1 h,電泳檢測酶切結(jié)果。

表1 pyrG基因的PCR 引物Table 1 The primers to amplify pyrG genes

1.2.8 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株的生長速率測定 PDA 平板上的生長速率:將金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株接種于PDA 平板上,25℃培養(yǎng)。當(dāng)菌絲開始萌發(fā)時,在菌絲的前端畫線當(dāng)作菌絲的生長起始線,3 d 后劃第2 條線,測量距離,計算日均生長速率,設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

PDAU 平板上的生長速率:將金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株接種于含有0.05 mmol·L-1尿嘧啶的PDA 平板上,并采用上述相同的培養(yǎng)方法和測量方法,測量生長速率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 軟件(IBM SPSS Statistics 19)對金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株生長速率的數(shù)據(jù)進行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇的單孢分離及單核菌絲群體的建立

3 株雜交菌株SGN1、SGN2 和SGN3 均能夠正常出菇,收集擔(dān)孢子。將孢子稀釋涂布于PDAUF 培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得325 個萌發(fā)菌落,其中SGN1 孢子再生菌株有111 株,SGN2 孢子再生菌株有110 株,SGN3 孢子再生菌株有104 株。在PDAU 培養(yǎng)基上經(jīng)過5 次轉(zhuǎn)接后置于顯微鏡下檢查,獲得無鎖狀聯(lián)合的單核體菌株206 株,其中SGN1 孢子單核體菌株有59 株,SGN2孢子單核體菌株有68 株,SGN3 孢子單核體菌株有79株,平均單核體比例為63.4%。這些尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體菌株能在MMU 和MMUF 培養(yǎng)基上生長但在MM 培養(yǎng)基上不生長(圖1)。

2.2 尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢子的交配

SGN1、SGN2 和SGN3 衍生的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢菌株中各隨機選取10 株分別進行兩兩配對。培養(yǎng)7 d 左右,挑出雜交融合處菌絲進行鏡檢,有鎖狀聯(lián)合的判定為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌絲。最終從SGN1 親本得到金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型自交雙核菌株12 個(命名為UG1-1 ～UG1-12),從SGN2 親本獲得雜交菌株12 個(命名為UG2-1～UG2-12),從SGN3親本獲得雜交菌株14 個(命名為UG3-1～UG3-14)。

圖1 尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體菌株SGN3-2 與G1 在不同培養(yǎng)基上的生長情況Fig.1 The growth of the uracil auxotrophic monokaryon SGN3-2 of F.velutipes and F.velutipes stain G1 strains on different medium

2.3 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體的5-FOA 驗證和分子鑒定

將雜交得到的38 株金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株繼代5 次后,分別接種于MM、MMU、MMUF培養(yǎng)基上,這些雜交菌株可以在MMU 和MMUF 培養(yǎng)基上生長但在MM 培養(yǎng)基上不生長(圖2)。

圖2 尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株UG1-6 與G1在不同培養(yǎng)基上的生長情況Fig.2 The growth of the uracil auxotrophic dikaryons UG1-6 of F.velutipes and F.velutipes stain G1 on different medium

提取金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株基因組DNA 進行pyrG基因的PCR 檢測。金針菇野生型菌株的pyrG基因共有3 個XhoⅠ酶切位,尿嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株NG1-92 的pyrG基因在236 位的堿基發(fā)生替換T→C,突變相應(yīng)引起XhoⅠ酶切位點(C/TCGAG)的缺失,只保留了2 個XhoⅠ酶切位,根據(jù)這個變化,設(shè)計出一種快速鑒定金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株的方法。提取尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株基因組DNA 后對pyrG基因進行PCR 擴增,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收,對回收產(chǎn)物進行XhoⅠ酶切,酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株的pyrG基因擴增產(chǎn)物有3 條酶切條帶(949、655、225 bp),野生型菌株有4 條酶切條帶(949、655、177、48 bp)(圖3)。

圖3 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株的pyrG 基因擴增片段的XhoⅠ酶切結(jié)果Fig.3 Uracil auxotrophic dikaryotic strains of F.velutipes cut by XhoⅠ

2.4 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的生長速率測定

隨機挑選15 株金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株(UG1-1、UG1-2、UG1-6、UG1-7、UG1-10、UG2-1、UG2-2、UG2-5、UG2-7、UG2-9、UG3-1、UG3-3、UG3-5、UG3-8、UG3-9)接種于PDA 培養(yǎng)基和PDAU培養(yǎng)基,待菌絲萌發(fā),3 d 后開始測量生長情況。由圖4 可知,15 株金針菇尿嘧啶缺陷型菌株在PDA 培養(yǎng)基上的生長速率平均為5.19 mm·d-1,普遍低于野生型G1 14.09 mm·d-1。在添加了尿嘧啶的PDAU 培養(yǎng)基上金針菇尿嘧啶缺陷型菌株生長速率平均為11.68 mm·d-1,與PDA 培養(yǎng)基上的生長速率相比都有不同程度的提高,平均增加了125.15%。而野生型G1 在添加了尿嘧啶PDA 的培養(yǎng)基上生長速率為13.91 mm·d-1,與在PDA 培養(yǎng)基上沒有太大變化,甚至還有所降低。表明尿嘧啶作為一種營養(yǎng)物質(zhì)有助于提高金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的生長速率。

3 討論

營養(yǎng)缺陷型菌株可進行產(chǎn)物代謝途徑分析,改變代謝通路積累目標(biāo)產(chǎn)物,該類菌株已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物領(lǐng)域[25-26]。目前已有將營養(yǎng)缺陷型菌株運用于食用菌中的研究報道,如曹照平等[27]通過超聲聯(lián)合1%硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選出了高產(chǎn)蟲草素的黃嘌呤和鳥嘌呤雙重營養(yǎng)缺陷型蛹蟲草菌株,為蟲草素的規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)支持。營養(yǎng)缺陷型菌株在育種學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域也有重要作用[28]。如孫丹[29]利用CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)對蛹蟲草中尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶基因RUA3(在金針菇中為pyrG基因)進行編輯,使其成為一種新型的分子標(biāo)記,為菌種優(yōu)化奠定了基因工程基礎(chǔ)。本試驗所獲得的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株中,反復(fù)繼代多次后尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型作為分子標(biāo)記保持了良好的繼代穩(wěn)定性,可作為分子生物學(xué)研究的宿主菌株。

誘變育種可以大大縮短育種年限,但誘變使基因突變方向不可控,誘發(fā)有益突變基因的頻率低,可能帶有額外的不理想的表型。本研究中有些雜合子在MMU 培養(yǎng)基上生長的菌絲形態(tài)和生長速度不同于PDAU 培養(yǎng)基,說明除pyrG基因突變外,紫外誘變還引起了其他基因的改變。實際應(yīng)用中需要擴大誘變后代群體來獲得所需要的表型。

尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是常見的營養(yǎng)缺陷型菌株,目前已經(jīng)在卷枝毛霉[30-31]、米曲霉[32]、假絲酵母和魯氏酵母[33]、香菇[34]等真菌中成功通過物理誘變、化學(xué)誘變或基因敲除技術(shù)獲得。尿嘧啶廣泛存在于生物中,在制備常用培養(yǎng)基所用的馬鈴薯、胰蛋白胨[35]、酵母提取物等成分中均含有痕量尿嘧啶,從而導(dǎo)致尿嘧啶缺陷型菌株的背景生長。為避免背景尿嘧啶的影響,篩選培養(yǎng)基選擇了不含尿嘧啶的基本培養(yǎng)基。本研究通過單單自交得到38 株金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株,這些菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培養(yǎng)基中無法正常生長,在PDA 培養(yǎng)基上生長速率低于野生型菌株,在添加尿嘧啶的PDAU 培養(yǎng)基上可以不同程度地恢復(fù)正常生長,表明尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株通過表型的差異可有效區(qū)分。

尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株在食用菌中的運用目前只在香菇中有相關(guān)報道,對香菇的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株進行栽培試驗,均可以正常獲得子實體[36]。表明營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株具有一定栽培價值和育種親本價值,進一步增大雜交菌株篩選數(shù)量有望獲得產(chǎn)量顯著提高的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株。實際生產(chǎn)應(yīng)用中,營養(yǎng)缺陷型菌種的出菇需要加入尿嘧啶,必定會增加生產(chǎn)成本,但是尿嘧啶缺陷型可以作為一種新型的分子標(biāo)記追蹤菌株,用于菌種鑒別。

4 結(jié)論

本研究通過單單自交獲得了金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株,且該金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型作為分子標(biāo)記可穩(wěn)定遺傳,這為利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的表型和基因型進行菌種保護和鑒別提供了技術(shù)基礎(chǔ)。下一步可利用尿嘧啶或者其他類型的營養(yǎng)缺陷型菌株的表型和基因型設(shè)計保護菌種和判別菌種的技術(shù)策略,建立一套利用營養(yǎng)缺陷型菌株開展金針菇雜交育種、菌種鑒別、知識產(chǎn)權(quán)保護的技術(shù)體系。

圖4 金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株在PDA 和PDAU 培養(yǎng)基上的生長速率Fig.4 Growth rate of uracil auxotrophic dikaryotic strains of F.velutipes on PDA and PDAU media