周彩瑩，零春甜，李欣憶，程鵬，汪建明*，鄭志強

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市利民調(diào)料有限公司，天津 300000；3.軍事科學院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術(shù)研究所，北京 100010）

亞麻又稱胡麻，是世界上最古老的經(jīng)濟作物之一。亞麻籽粕是亞麻籽油提取后的副產(chǎn)物，蛋白資源豐富[1]，其含量占亞麻籽粕的41.45%[2]，并且該蛋白質(zhì)具有良好的乳化、保水、溶解和泡沫穩(wěn)定性[3]；亞麻籽粕中氨基酸含量極高，組成和比例接近世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）規(guī)定的適宜人體氨基酸模式的要求[4]。但是，目前亞麻籽粕通常被當作垃圾或動物飼料處理，價值低廉，造成了資源浪費。

黑曲霉菌作為世界公認的安全可食用性霉，主要分泌酸性蛋白酶，符合食品安全的需求[5]，并且所得水解物蛋白質(zhì)含量高[6-7]。酸性蛋白酶和中性蛋白酶共同作用亞麻籽粕有利于游離氨基酸的釋放和特征風味的形成[8]。馮金曉等[9]利用中性蛋白酶對紅島蛤蜊進行酶解，測得的氨基態(tài)氮含量是1.094 g/100 g。李業(yè)祿等[10]采用4種酶對菜籽粕進行單酶和復合酶處理，結(jié)果表明復合酶水解產(chǎn)生的效果優(yōu)于單酶；馮結(jié)鏵等[11]利用超聲輔助酶解法酶解亞麻籽粕，結(jié)果表明在復合蛋白酶添加量為3%、pH9.4、45℃下，水解度可達到31.72%，水解液中游離氨基酸含量為2.859 mg/mL。

菌酶協(xié)同處理增強風味就是采用發(fā)酵與酶解相結(jié)合的方法將植物蛋白降解為多肽和氨基酸等物質(zhì)，從而形成產(chǎn)品特征風味[12]。研究表明，食品中風味化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密[13]，戴梓茹等[14]研究表明多肽能產(chǎn)生特征性風味；除此之外，分子量大于1 000 Da的多肽可以改善湯的口感，分子量在128 Da～1 000 Da的多肽除了影響其他感官特征外，主要有類肉風味[15]。因此，菌酶協(xié)同處理強化亞麻籽粕風味，可以為研究亞麻籽粕發(fā)酵酶解產(chǎn)生風味物質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

亞麻籽粕：天津慧智百川生物工程有限公司（蛋白質(zhì)含量32.8%，粗脂肪含量1.8%）；黑曲霉粉（Aspergillus niger）：汾源康源生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg）：青島吉寶中新國際貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、95%乙醇、異丙醇（分析純）：天津市津東天正精細化學試劑廠；酚酞指示劑：天津市化學試劑一廠；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津大學科威公司；甲醛（分析純）：天津市大茂化學試劑廠甲醛公司。

1.2 儀器與設備

滅菌鍋（SN310C）：重慶雅馬拓科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082BS）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；三溫三控水槽（DK-8D）、電熱鼓風干燥箱（DF-101S）：上海博順實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；醫(yī)用離心機（TQ16-93）：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻籽粕發(fā)酵酶解液的風味感官評定

請10位經(jīng)過感官分析培訓的食品專業(yè)評定人員，對亞麻籽粕原料、黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕產(chǎn)物、亞麻籽粕發(fā)酵酶解液的香氣、色澤、組織狀態(tài)、總體評價進行評分，滿分40分，感官評分標準如表1所示。

表1 風味感官評分標準Table 1 Flavor and sensory evaluation standard

1.3.2 游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）含量的測定

參照Lam等[16]的研究，采用異丙醇-0.01 mol/L氫氧化鉀滴定法測定樣品中的FFA。

1.3.3 氨基態(tài)氮的測定

采用國標GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的甲醛值法測定氨基酸態(tài)氮含量[17]。

1.3.4 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗

亞麻籽粕與水分的料水比1∶1.5（g/mL），黑曲霉接種量4%（基于亞麻籽粕），葡萄糖添加量6%（基于亞麻籽粕），37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d作為單因素試驗條件，每天在無菌條件下攪拌1次～2次，以FFA和氨基態(tài)氮含量為指標，選擇料水比 1 ∶0.5、1 ∶1.0、1 ∶1.5、1 ∶2.0、1 ∶2.5（g/mL）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、葡萄糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵時間（2、3、4、5、6、7 d）4 個因素進行單因素試驗，并選擇對指標影響較大的水平進行正交試驗。

1.3.5 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交試驗

根據(jù)黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗結(jié)果，設計L9（34）正交試驗，測定氨基態(tài)氮和FFA，確定最佳的發(fā)酵條件。因素與水平見表2。

表2 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交設計試驗因素與水平設計Table 2 Orthogonal design factors and level of flaxseed meal fermented by Aspergillus niger

1.3.6 中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物單因素試驗

選取1.3.5確定的最佳發(fā)酵條件下的亞麻籽粕發(fā)酵物，將其配制成5%的發(fā)酵液進行酶解試驗。選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間為單因素試驗條件，以FFA和氨基態(tài)氮含量為指標，選擇酶用量（1%、2%、3%、4%、5%）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（1、2、3、4、5 h）3 個因素進行單因素試驗，并選擇對指標影響較大的水平進行正交試驗。

1.3.7 中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物正交試驗

根據(jù)中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物單因素試驗結(jié)果，設計L9（33）正交試驗，測定氨基態(tài)氮和FFA，確定最佳的酶解條件，因素與水平見表3。

表3 中性蛋白酶酶解發(fā)酵產(chǎn)物正交設計試驗因素與水平設計Table 3 Factors and levels of orthogonal design of neutral protease hydrolysates

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次，采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果保留兩位小數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗

根據(jù)1.3.4所述的方法進行黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗，按照1.3.2、1.3.3所述的方法測定FFA和氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如圖1所示。

根據(jù)圖1A所示，亞麻籽粕與水分的料水比為1 ∶1.5（g/mL）時，F(xiàn)FA最高，達到0.35%，此時氨基態(tài)氮為1.07 g/100 g，也處于較高水平；料水比為 1 ∶2.0（g/mL）～1∶2.5（g/mL）時，F(xiàn)FA 下降；氨基態(tài)氮含量隨著料水比呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。起初可能由于固態(tài)發(fā)酵，底物的水分含量較低，而黑曲霉對水分要求過高；隨著水分含量升高，黑曲霉生長受到抑制。綜合考慮兩個指標，選擇料水比1∶1.5（g/mL）進行后續(xù)試驗。

圖1 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕游離脂肪酸和氨基態(tài)氮的研究Fig.1 Study on FFA and amino nitrogen of flaxseed meal fermented by Aspergillus niger

根據(jù)圖1B所示，隨著接種量增加，F(xiàn)FA先升高后降低再升高，這可能是由于黑曲霉增多，底物含量有限，菌種之間互相抑制生長[18]；當接種量為4%時，F(xiàn)FA最高，為0.37%；隨著接種量增加，氨基態(tài)氮含量先增加至穩(wěn)定，后下降。在接種量為4%時，兩指標含量都較高，因此選擇接種量4%進行后續(xù)試驗。

根據(jù)圖1C所示，當葡萄糖添加量為發(fā)酵底物的6%和8%時，F(xiàn)FA最高，達到0.37%；氨基態(tài)氮含量隨著葡萄糖添加量的增加呈現(xiàn)先增加至最高點，后下降，之后又緩慢增加。這可能是由于起初葡萄糖添加量較少，碳源不充足，不能滿足黑曲霉的生長需要[19-20]，而過多的葡萄糖抑制黑曲霉與底物的接觸。葡萄糖添加量為6%時，兩個指標含量都最高，因此在后續(xù)試驗里選擇葡萄糖添加量為6%。

根據(jù)圖1D所示，在發(fā)酵時間為4 d時，F(xiàn)FA和氨基態(tài)氮含量都很高，其中FFA為0.42%，氨基態(tài)氮為1.50 g/100 g。這可能是由于黑曲霉隨著發(fā)酵天數(shù)延長，種群達到指數(shù)增長[21]；到第4天時，種群到達最大值；第4天以后，種群到達衰亡期，黑曲霉數(shù)量大大減少，發(fā)酵效率降低[22]。

2.2 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交試驗

以黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對FFA和氨基態(tài)氮含量影響較大的水平進行正交試驗。采用異丙醇-0.01 mol/L氫氧化鉀滴定法測定樣品中的FFA，甲醛滴定法測定氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如表4所示。

對數(shù)據(jù)結(jié)果進行極差分析，結(jié)果表明，以FFA為指標的最優(yōu)條件為 A3B1C2D3，即料水比 1∶2.0（g/mL），接種量2%，葡萄糖添加量6%，發(fā)酵5 d；而正交結(jié)果表明最佳條件為 A3B1C3D2，即料水比 1 ∶2.0（g/mL），接種量2%，葡萄糖添加量8%，發(fā)酵4 d；此時FFA為0.45%，氨基態(tài)氮含量為1.63 g/100 g。以氨基態(tài)氮為指標的最優(yōu)條件為 A1B3C2D3，即料水比 1 ∶1.0（g/mL），接種量6%，葡萄糖添加量6%，發(fā)酵5 d；正交結(jié)果表明最佳條件為 A1B3C3D3，即料水比 1 ∶1.0（g/mL），接種量6%，葡萄糖添加量8%，發(fā)酵5 d；此時氨基態(tài)氮含量為1.80 g/100 g，F(xiàn)FA為0.43%。

表4 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results of flaxseed meal fermented by Aspergillus niger

2.3 黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕驗證試驗

2.3.1 以FFA為指標的驗證試驗

通過極差分析，確定最佳發(fā)酵條件為料水比1∶2.0（g/mL）、接種量 2%、葡萄糖添加量為 6%、發(fā)酵5 d，在此條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果取平均值，結(jié)果表明FFA可達0.54%，比優(yōu)化前（0.45%）提高20%，相對標準偏差 （relative standard deviation，RSD）是0.28%，此時氨基態(tài)氮含量為1.77 g/100 g，比優(yōu)化前（1.63 g/100 g）提高8.59%。

2.3.2 以氨基態(tài)氮為指標的驗證試驗

通過極差分析，確定最佳發(fā)酵條件為料水比1∶1.0（g/mL）、接種量 6%、葡萄糖添加量為 6%、發(fā)酵5 d，在此條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果取平均值，結(jié)果表明氨基態(tài)氮含量可達1.92 g/100 g，比優(yōu)化前（1.80 g/100 g）提高6.67%，RSD是0.16%，此時FFA為0.56%，比優(yōu)化前（0.43%）提高30.23%。

結(jié)果表明，以氨基態(tài)氮為指標的驗證試驗（2.3.2）得到的兩個指標含量都高于以FFA為指標的驗證試驗（2.3.1），同時高于未優(yōu)化之前；FFA為0.56%，氨基態(tài)氮含量為1.92 g/100 g，RSD較小。因此，選擇料水比1∶1.0（g/mL）、接種量6%、葡萄糖添加量6%、發(fā)酵5 d作為最優(yōu)發(fā)酵條件，為下一步的酶解部分做好準備。

2.4 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液單因素試驗

根據(jù)1.3.6所述的方法進行中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液單因素試驗，按照1.3.2、1.3.3所述的方法測定FFA和氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕發(fā)酵液游離脂肪酸和氨基態(tài)氮的研究Fig.2 Enzymatic hydrolysis of free fatty acids and amino nitrogen in flaxseed meal fermentation broth by neutral protease

根據(jù)圖2a所示，在中性蛋白酶用量為3%時，兩個指標均較高，此時FFA達到12.00%，氨基態(tài)氮含量為1.95 g/100 g，這可能是由于隨著酶的增加，酶與底物充分結(jié)合；當酶添加量超過3%時，酶量過多，底物不足，過量的酶與生成物結(jié)合，抑制產(chǎn)物的釋放[23]。雖然加酶量為5%時，指標含量也較高，但與3%時相差不太，考慮成本和生產(chǎn)實際要求，選擇加酶量3%進行后續(xù)試驗。

根據(jù)圖2b所示，溫度40℃～50℃時，氨基態(tài)氮含量先減小后增大；在反應50℃時氨基態(tài)氮含量為1.94 g/100 g，F(xiàn)FA為13.50%，此時達到最高值，這可能是因為溫度升高，酶活力增強反應速率加快；之后，隨著溫度升高，氨基態(tài)氮含量大致呈下降趨勢，說明中性蛋白酶在50℃活性最強。因此選擇酶解溫度為50℃進行后續(xù)試驗。

根據(jù)圖2c所示，酶解2 h時，兩個指標含量都較高，說明隨著時間的延長，中性蛋白酶與發(fā)酵亞麻籽粕反應越充分；3 h～5 h時兩個指標含量均較低，這說明底物和酶已充分反應，底物也不再隨著時間的延長而被逐漸分解[24]，考慮到1 h時，兩指標含量均過低，因此，選擇酶解時間3 h進行后續(xù)試驗。

2.5 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液正交試驗

以中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對FFA和氨基態(tài)氮含量影響較大的水平進行正交試驗。采用異丙醇-0.01 mol/L氫氧化鉀滴定法測定樣品中的FFA，甲醛滴定法測定氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如表5所示。

表5 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal experiment design and results of neutral protease hydrolysis of flaxseed meal mold fermentation broth

對數(shù)據(jù)結(jié)果進行極差分析，比較各因素不同水平，a1、b3、c1為最優(yōu)水平，即以FFA和氨基態(tài)氮為指標的最優(yōu)條件為加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解2 h；直觀分析表明，第9組氨基態(tài)氮和FFA最高，此時組合為a3b3c1，即加酶量為4%，溫度55℃，時間2 h，此時氨基態(tài)氮含量為3.67 g/100 g，F(xiàn)FA為22.06%。

2.6 中性蛋白酶酶解亞麻籽粕霉菌發(fā)酵液驗證試驗

通過極差分析，以FFA和氨基態(tài)氮為指標，確定最佳酶解條件為加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解2 h，在此條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果取平均值，結(jié)果表明FFA含量可達22.10%，比優(yōu)化前（22.06%）提高0.18%，RSD是0.13%；氨基態(tài)氮含量為4.03 g/100 g，比優(yōu)化前（3.67 g/100 g）提高9.81%，RSD是0.06%。結(jié)果表明，酶解最優(yōu)條件為：加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解2 h。

2.7 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵亞麻籽粕-中性蛋白酶酶解產(chǎn)物風味評價

2.7.1 FFA和氨基態(tài)氮分析

對亞麻籽粕，亞麻籽粕發(fā)酵物，亞麻籽粕發(fā)酵酶解液進行各樣品指標含量分析，結(jié)果如表6所示。

表6 各樣品指標含量分析Table 6 Index content analysis of each sample

2.7.2 感官評價

根據(jù)1.3.1，對亞麻籽粕，亞麻籽粕發(fā)酵物，亞麻籽粕發(fā)酵酶解液進行風味感官評分，結(jié)果見表7。

表7 感官評價得分Table 7 Sensory evaluation score

根據(jù)表7所示，亞麻籽粕經(jīng)過發(fā)酵、酶解過程，香氣、色澤、組織狀態(tài)、總體評價分值都逐步提高，具有顯著性差異，其中亞麻籽粕發(fā)酵酶解液香氣濃郁、無異味；色澤均勻一致；組織狀態(tài)細膩、均勻。分析其原因可能是經(jīng)過微生物發(fā)酵、酶解兩步，亞麻籽粕含有的蛋白質(zhì)、脂肪等發(fā)生降解，生成小分子物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究采用發(fā)酵酶解兩步法增強亞麻籽粕風味。結(jié)果表明，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵亞麻籽粕優(yōu)化條件為料水比 1∶1.0（g/mL），接種量 6%（基于亞麻籽粕），葡萄糖添加量6%（基于亞麻籽粕），在37℃條件下發(fā)酵5 d；中性蛋白酶酶解亞麻籽粕發(fā)酵液優(yōu)化條件為加酶量2%，55℃酶解2 h，相比于未發(fā)酵的亞麻籽粕，氨基態(tài)氮含量增加4.03 g/100 g，F(xiàn)FA含量擴大246倍；香氣濃郁、無異味；色澤均勻一致；組織狀態(tài)細膩、均勻。本研究為進一步研究亞麻籽粕發(fā)酵酶解產(chǎn)生風味物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。