王樹慶，李保國(guó)，范維江*，姜薇薇，李永正

（1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103；2.山東葡萄研究院，山東 濟(jì)南 250103；3.煙臺(tái)同心酒業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 264000）

二氧化硫或其衍生物（亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽）被廣泛地應(yīng)用于葡萄的采摘、釀制過程中，以起到保鮮、殺菌、抗氧化、穩(wěn)定的作用[1-6]。從古代起，人們便使用硫磺來(lái)為葡萄酒殺菌。歐盟法律規(guī)定干紅葡萄酒中SO2的總量上限為160 mg/L，干白和桃紅葡萄酒中SO2的含量上限為210 mg/L[7]，澳大利亞為250 mg/L～300 mg/L，新西蘭為 250 mg/L～400 mg/L[8]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定當(dāng)葡萄酒中亞硫酸鹽含量超過10 mg/L時(shí)，必須在標(biāo)準(zhǔn)中予以標(biāo)明[9]。我國(guó)對(duì)二氧化硫作為葡萄酒的添加劑，在使用量上也有嚴(yán)格的規(guī)定，作為添加劑的使用最高值為250 mg/L，二氧化硫殘留量不得超過50 mg/L[10]。我國(guó)有機(jī)葡萄酒GB/T 19630—2011《有機(jī)產(chǎn)品》中規(guī)定，紅葡萄酒的最大使用量為100 mg/L，白葡萄酒、桃紅葡萄酒二氧化硫最大使用量為150 mg/L[11]。

葡萄酒中添加SO2，不但會(huì)影響葡萄酒的風(fēng)味，而且也對(duì)人體健康不利，尤其對(duì)過敏體質(zhì)者和哮喘病人會(huì)誘發(fā)一些身體問題[12-17]聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)（Joint Expert Commttee on Food Additives Committee，JECFA） 制定的 SO2安全攝入限量是每天每千克體重0.7 mg。對(duì)于一個(gè)60 kg的成年人，相當(dāng)于每天攝入量不能超過42 mg[8]。針對(duì)葡萄酒中亞硫酸鹽的危害問題，Brown利用離子交換樹脂來(lái)吸附葡萄酒中的亞硫酸鹽[18]，而Seifter等則采用含固定氧化劑的膜來(lái)去除葡萄酒中亞硫酸鹽[19]，這兩種方法都能使葡萄酒中的亞硫酸鹽降到0.01 mg/mL以下，但是由于其作用機(jī)制的非選擇性，結(jié)果會(huì)造成葡萄酒中一些成分的損失，從而影響葡萄酒的質(zhì)量。Lin等利用從麥苗中提取的葉綠體對(duì)葡萄酒中的亞硫酸鹽清除情況進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能夠有效地除去葡萄酒中的亞硫酸鹽，但是需要將葡萄酒的pH值調(diào)至8.5時(shí)，去除效率最好，而且該方法對(duì)白葡萄酒的處理效果要好于紅葡萄酒，同時(shí)發(fā)現(xiàn)光照對(duì)去除效果有一定的促進(jìn)作用，顯然該方法存在一定缺陷[20]。

亞硫酸鹽氧化酶能夠?qū)Ｒ恍詫喠蛩猁}氧化成硫酸鹽，但是由于這種酶的復(fù)雜性，目前還未有商業(yè)化生產(chǎn)。葉綠體作為一種天然的生物催化劑，存在于絕大多數(shù)的綠色植物葉片中。葉綠體在一定條件下通過代謝途徑對(duì)低濃度的亞硫酸鹽溶液具有良好的氧化并脫除的效果[21]。本研究對(duì)從新鮮菠菜中提取的葉綠體內(nèi)含物進(jìn)行了改進(jìn)，并對(duì)改進(jìn)后的菠菜提取物去除葡萄酒中的亞硫酸鹽情況進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 原料

紅葡萄酒、白葡萄酒：煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸丫朴邢薰?；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、過氧化氫（以上試劑均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ME204T/02電子天平：梅特勒-托利多公司；H1650-W臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)有限公司；101型真空干燥機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 菠菜提取物的制備

選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈，擦干后去除葉梗，用高速組織破碎機(jī)破碎成勻漿，6層紗布過濾除去粗纖維，所得濾液于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集含葉綠體的內(nèi)容物（線粒體、溶酶體、微體）的沉淀，真空干燥、復(fù)配、密封、干燥處保藏、備用。

1.3 葡萄酒中二氧化硫的測(cè)定

按照國(guó)標(biāo)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中SO2的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[22]。

1.4 葡萄酒中二氧化硫去除單因素試驗(yàn)

分別取50 mL葡萄酒置于250 mL的三角瓶中，然后測(cè)定菠菜提取物在不同使用量、處理時(shí)間、pH值和酒精度等各種條件下二氧化硫的去除情況。其中，試驗(yàn)過程中葡萄酒pH值的調(diào)整用0.1mol/L的氫氧化鈉進(jìn)行，除非特別說明，所有試驗(yàn)均在25℃室溫條件下進(jìn)行。

1.5 葡萄酒中二氧化硫去除正交試驗(yàn)

在葡萄酒中二氧化硫去除單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取菠菜提取物用量0.3、0.4、0.5 mg/mL；處理時(shí)間 4、6、120 min；pH 值 3.5、7.0、9.0；和乙醇濃度12.5%、22.5%、27.5%，為自變量，以 1、2、3水平進(jìn)行編碼，以總二氧化硫清除率為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交因素水平Table 1 The factors and levels for the orthogonal design

1.6 去硫葡萄酒的感官評(píng)價(jià)

葡萄酒的感官品質(zhì)包括葡萄酒的外觀、香氣、滋味以及是否具有典型性，因酒齡、品種、種植條件的不同，葡萄酒帶給人的感覺也千變?nèi)f化，本研究對(duì)去除二氧化硫后的葡萄酒進(jìn)行感官評(píng)定，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 葡萄酒感官評(píng)分原則Table 2 Sensory scoring principles of wine

續(xù)表2 葡萄酒感官評(píng)分原則Continue table 2 Sensory scoring principles of wine

1.7 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)利用正交設(shè)計(jì)助手II和SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＞0.05為差異不顯著；P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜提取物用量對(duì)除硫效果的影響

分別使用 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的菠菜提取物，按照1.4的方法進(jìn)行葡萄酒中二氧化硫去除試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 菠菜提取物用量對(duì)除硫效果的影響Fig.1 Effect of spinach extract dosage on sulfur removal

由圖1可以看出，隨著菠菜提取物用量的增加，除二氧化硫效果明顯提高，當(dāng)菠菜提取物用量為0.2 mg/mL時(shí)，葡萄酒中的游離二氧化硫被完全去除，而當(dāng)菠菜提取物使用量為0.4 mg/mL時(shí)，除總二氧化硫（包括游離二氧化硫與結(jié)合二氧化硫）效率可達(dá)92%，隨著菠菜提取物用量的進(jìn)一步提高，葡萄酒中的總二氧化硫可降到0.01 mg/mL以下。根據(jù)感官品評(píng)結(jié)果，當(dāng)菠菜提取物用量超過0.4 mg/mL時(shí)，葡萄酒的口感則有明顯的氧化味，因此，在使用過程中應(yīng)將菠菜提取物的最適使用量控制在0.4 mg/mL以內(nèi)。Lin等利用酶法來(lái)去除葡萄酒中的二氧化硫[20]，當(dāng)酶使用量為10 mg/mL時(shí)，其除二氧化硫率可達(dá)95%。因此，本研究菠菜提取物的使用量較少，約為L(zhǎng)in等研究量1/25。

2.2 處理時(shí)間對(duì)去除硫效果的影響

按照0.4 mg/mL的菠菜提取物使用量，研究不同處理時(shí)間對(duì)葡萄酒中（總二氧化硫含量為0.136 5 mg/mL）二氧化硫的去除效果，結(jié)果見圖2。

圖2 處理時(shí)間對(duì)除二氧化硫效率的影響Fig.2 Effect of treatment time on SO2removal

由圖2可以看出，采用菠菜提取物處理的時(shí)間非常短，當(dāng)處理時(shí)間為6 min時(shí)，去除二氧化硫效率可達(dá)92.77%，進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不大，而且，處理時(shí)間增加會(huì)進(jìn)一步增加葡萄酒的氧化，嚴(yán)重影響葡萄酒的質(zhì)量。Lin等利用酶法來(lái)去除葡萄酒中的二氧化硫，當(dāng)酶使用量為10 mg/mL時(shí)，除二氧化硫率為95%時(shí)，則需要 1 h[20]。

2.3 pH值對(duì)除硫效果的影響

菠菜提取物用量為0.4 mg/mL，用氫氧化鈉溶液對(duì)葡萄酒的pH值進(jìn)行調(diào)整，然后測(cè)定不同pH值條件菠菜提取物的除二氧化硫情況，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對(duì)二氧化硫處理情況的影響Fig.3 Effect of pH on SO2removal

由圖3可以看出，pH值對(duì)菠菜提取物法除去葡萄酒中的二氧化硫影響不大，因此，在使用菠菜提取物法去除葡萄酒中的二氧化硫時(shí)不需要對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)整。而Lin等利用酶法來(lái)去除葡萄酒中的二氧化硫，則需要將葡萄酒的pH值調(diào)整到8.5左右，由于葡萄酒的pH值一般低于4.0，因此，采用離子交換法和Lin等方法時(shí)[20]，需要對(duì)處理后葡萄酒的pH值進(jìn)行調(diào)整，顯然這必將會(huì)對(duì)葡萄酒的質(zhì)量，特別是感官和口感造成一定的影響。

2.4 乙醇濃度對(duì)除硫效果的影響

用無(wú)水乙醇分別將葡萄酒的乙醇含量調(diào)至12.5%、22.5%和27.5%，然后測(cè)定菠菜提取物在不同酒精度下的除硫情況，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，乙醇濃度對(duì)二氧化硫的清除率有一定影響，但影響不是太大。采用Lin等方法時(shí)，葡萄酒的酒精含量會(huì)對(duì)處理結(jié)果有影響[20]。

圖4 乙醇濃度對(duì)處理結(jié)果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on sulfite removal

2.5 正交試驗(yàn)

綜合試驗(yàn)過程與結(jié)果，以總二氧化硫作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，依據(jù)表1進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，用SPSS和正交助手軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 葡萄酒中二氧化硫去除效果正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment for SO2removal in wine

由表3可知，試驗(yàn)5效果最佳，其總二氧化硫清除率最高，試驗(yàn)5與試驗(yàn)4和6差異顯著，與其他試驗(yàn)小組比較差異極顯著。由試驗(yàn)結(jié)果的極差值可知，本試驗(yàn)的影響因素菠菜提取物用量＞處理時(shí)間＞pH值＞乙醇濃度，其中菠菜提取物用量因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，其中菠菜提取物用量0.4 mg/mL時(shí)的效果最好。

本研究對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，取菠菜提取物用量0.4 mg/mL、處理時(shí)間6 min、pH3.5（葡萄酒正常的pH值）、乙醇濃度12.5%（葡萄酒正常的乙醇濃度），總二氧化硫去除率為94.36%，與正交試驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異。

2.6 菠菜提取物用量對(duì)葡萄酒感官的影響

按照100分葡萄酒感官評(píng)分原則，對(duì)去除二氧化硫后的葡萄酒進(jìn)行品評(píng)，結(jié)果見表4。

表4 葡萄酒感官品評(píng)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of wine

由表4可以看出，去二氧化硫的葡萄酒在感官品評(píng)方面要好于未處理的葡萄酒，品評(píng)人員明顯感覺，經(jīng)去二氧化硫后的葡萄酒幾乎聞不到硫臭味，而且入口后整體協(xié)調(diào)性也明顯好于未處理的葡萄酒。

3 結(jié)論

葡萄酒中添加二氧化硫是人類長(zhǎng)期實(shí)踐的結(jié)果，但是對(duì)于一些二氧化硫敏感患者來(lái)說，葡萄酒中的二氧化硫則是非常危險(xiǎn)的。目前已報(bào)道的葡萄酒除硫技術(shù)不但過程復(fù)雜，而且嚴(yán)重影響葡萄酒的質(zhì)量。本研究研制的菠菜提取物技術(shù)，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單，使用量少，除硫速度快，效率高，同時(shí)不受pH值的影響，除硫后的葡萄酒口感明顯優(yōu)于處理前的產(chǎn)品，因此，本研究的成果，將為無(wú)硫葡萄酒的研制提供理論上的支撐。