王樹慶，李保國，范維江*，姜薇薇，李永正

（1.山東商業(yè)職業(yè)技術學院，山東 濟南 250103；2.山東葡萄研究院，山東 濟南 250103；3.煙臺同心酒業(yè)有限公司，山東 煙臺 264000）

二氧化硫或其衍生物（亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽）被廣泛地應用于葡萄的采摘、釀制過程中，以起到保鮮、殺菌、抗氧化、穩(wěn)定的作用[1-6]。從古代起，人們便使用硫磺來為葡萄酒殺菌。歐盟法律規(guī)定干紅葡萄酒中SO2的總量上限為160 mg/L，干白和桃紅葡萄酒中SO2的含量上限為210 mg/L[7]，澳大利亞為250 mg/L～300 mg/L，新西蘭為 250 mg/L～400 mg/L[8]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，FDA）規(guī)定當葡萄酒中亞硫酸鹽含量超過10 mg/L時，必須在標準中予以標明[9]。我國對二氧化硫作為葡萄酒的添加劑，在使用量上也有嚴格的規(guī)定，作為添加劑的使用最高值為250 mg/L，二氧化硫殘留量不得超過50 mg/L[10]。我國有機葡萄酒GB/T 19630—2011《有機產品》中規(guī)定，紅葡萄酒的最大使用量為100 mg/L，白葡萄酒、桃紅葡萄酒二氧化硫最大使用量為150 mg/L[11]。

葡萄酒中添加SO2，不但會影響葡萄酒的風味，而且也對人體健康不利，尤其對過敏體質者和哮喘病人會誘發(fā)一些身體問題[12-17]聯合國糧食與農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）聯合食品添加劑專家委員會（Joint Expert Commttee on Food Additives Committee，JECFA） 制定的 SO2安全攝入限量是每天每千克體重0.7 mg。對于一個60 kg的成年人，相當于每天攝入量不能超過42 mg[8]。針對葡萄酒中亞硫酸鹽的危害問題，Brown利用離子交換樹脂來吸附葡萄酒中的亞硫酸鹽[18]，而Seifter等則采用含固定氧化劑的膜來去除葡萄酒中亞硫酸鹽[19]，這兩種方法都能使葡萄酒中的亞硫酸鹽降到0.01 mg/mL以下，但是由于其作用機制的非選擇性，結果會造成葡萄酒中一些成分的損失，從而影響葡萄酒的質量。Lin等利用從麥苗中提取的葉綠體對葡萄酒中的亞硫酸鹽清除情況進行了研究，結果發(fā)現該方法能夠有效地除去葡萄酒中的亞硫酸鹽，但是需要將葡萄酒的pH值調至8.5時，去除效率最好，而且該方法對白葡萄酒的處理效果要好于紅葡萄酒，同時發(fā)現光照對去除效果有一定的促進作用，顯然該方法存在一定缺陷[20]。

亞硫酸鹽氧化酶能夠專一性將亞硫酸鹽氧化成硫酸鹽，但是由于這種酶的復雜性，目前還未有商業(yè)化生產。葉綠體作為一種天然的生物催化劑，存在于絕大多數的綠色植物葉片中。葉綠體在一定條件下通過代謝途徑對低濃度的亞硫酸鹽溶液具有良好的氧化并脫除的效果[21]。本研究對從新鮮菠菜中提取的葉綠體內含物進行了改進，并對改進后的菠菜提取物去除葡萄酒中的亞硫酸鹽情況進行研究。

1 材料與方法

1.1 原料

紅葡萄酒、白葡萄酒：煙臺張裕葡萄酒有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、過氧化氫（以上試劑均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

ME204T/02電子天平：梅特勒-托利多公司；H1650-W臺式離心機：湖南湘儀離心機有限公司；101型真空干燥機：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 菠菜提取物的制備

選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈，擦干后去除葉梗，用高速組織破碎機破碎成勻漿，6層紗布過濾除去粗纖維，所得濾液于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集含葉綠體的內容物（線粒體、溶酶體、微體）的沉淀，真空干燥、復配、密封、干燥處保藏、備用。

1.3 葡萄酒中二氧化硫的測定

按照國標GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中SO2的測定方法進行測定[22]。

1.4 葡萄酒中二氧化硫去除單因素試驗

分別取50 mL葡萄酒置于250 mL的三角瓶中，然后測定菠菜提取物在不同使用量、處理時間、pH值和酒精度等各種條件下二氧化硫的去除情況。其中，試驗過程中葡萄酒pH值的調整用0.1mol/L的氫氧化鈉進行，除非特別說明，所有試驗均在25℃室溫條件下進行。

1.5 葡萄酒中二氧化硫去除正交試驗

在葡萄酒中二氧化硫去除單因素試驗的基礎上進行正交試驗設計，選取菠菜提取物用量0.3、0.4、0.5 mg/mL；處理時間 4、6、120 min；pH 值 3.5、7.0、9.0；和乙醇濃度12.5%、22.5%、27.5%，為自變量，以 1、2、3水平進行編碼，以總二氧化硫清除率為響應值進行四因素三水平試驗設計，試驗因素和水平設計見表1。

表1 正交因素水平Table 1 The factors and levels for the orthogonal design

1.6 去硫葡萄酒的感官評價

葡萄酒的感官品質包括葡萄酒的外觀、香氣、滋味以及是否具有典型性，因酒齡、品種、種植條件的不同，葡萄酒帶給人的感覺也千變萬化，本研究對去除二氧化硫后的葡萄酒進行感官評定，感官評分標準如表2所示。

表2 葡萄酒感官評分原則Table 2 Sensory scoring principles of wine

續(xù)表2 葡萄酒感官評分原則Continue table 2 Sensory scoring principles of wine

1.7 數據處理

所得數據利用正交設計助手II和SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，P＞0.05為差異不顯著；P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 菠菜提取物用量對除硫效果的影響

分別使用 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的菠菜提取物，按照1.4的方法進行葡萄酒中二氧化硫去除試驗，結果見圖1。

圖1 菠菜提取物用量對除硫效果的影響Fig.1 Effect of spinach extract dosage on sulfur removal

由圖1可以看出，隨著菠菜提取物用量的增加，除二氧化硫效果明顯提高，當菠菜提取物用量為0.2 mg/mL時，葡萄酒中的游離二氧化硫被完全去除，而當菠菜提取物使用量為0.4 mg/mL時，除總二氧化硫（包括游離二氧化硫與結合二氧化硫）效率可達92%，隨著菠菜提取物用量的進一步提高，葡萄酒中的總二氧化硫可降到0.01 mg/mL以下。根據感官品評結果，當菠菜提取物用量超過0.4 mg/mL時，葡萄酒的口感則有明顯的氧化味，因此，在使用過程中應將菠菜提取物的最適使用量控制在0.4 mg/mL以內。Lin等利用酶法來去除葡萄酒中的二氧化硫[20]，當酶使用量為10 mg/mL時，其除二氧化硫率可達95%。因此，本研究菠菜提取物的使用量較少，約為Lin等研究量1/25。

2.2 處理時間對去除硫效果的影響

按照0.4 mg/mL的菠菜提取物使用量，研究不同處理時間對葡萄酒中（總二氧化硫含量為0.136 5 mg/mL）二氧化硫的去除效果，結果見圖2。

圖2 處理時間對除二氧化硫效率的影響Fig.2 Effect of treatment time on SO2removal

由圖2可以看出，采用菠菜提取物處理的時間非常短，當處理時間為6 min時，去除二氧化硫效率可達92.77%，進一步延長處理時間對結果影響不大，而且，處理時間增加會進一步增加葡萄酒的氧化，嚴重影響葡萄酒的質量。Lin等利用酶法來去除葡萄酒中的二氧化硫，當酶使用量為10 mg/mL時，除二氧化硫率為95%時，則需要 1 h[20]。

2.3 pH值對除硫效果的影響

菠菜提取物用量為0.4 mg/mL，用氫氧化鈉溶液對葡萄酒的pH值進行調整，然后測定不同pH值條件菠菜提取物的除二氧化硫情況，結果見圖3。

圖3 pH值對二氧化硫處理情況的影響Fig.3 Effect of pH on SO2removal

由圖3可以看出，pH值對菠菜提取物法除去葡萄酒中的二氧化硫影響不大，因此，在使用菠菜提取物法去除葡萄酒中的二氧化硫時不需要對pH值進行調整。而Lin等利用酶法來去除葡萄酒中的二氧化硫，則需要將葡萄酒的pH值調整到8.5左右，由于葡萄酒的pH值一般低于4.0，因此，采用離子交換法和Lin等方法時[20]，需要對處理后葡萄酒的pH值進行調整，顯然這必將會對葡萄酒的質量，特別是感官和口感造成一定的影響。

2.4 乙醇濃度對除硫效果的影響

用無水乙醇分別將葡萄酒的乙醇含量調至12.5%、22.5%和27.5%，然后測定菠菜提取物在不同酒精度下的除硫情況，結果見圖4。

由圖4可以看出，乙醇濃度對二氧化硫的清除率有一定影響，但影響不是太大。采用Lin等方法時，葡萄酒的酒精含量會對處理結果有影響[20]。

圖4 乙醇濃度對處理結果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on sulfite removal

2.5 正交試驗

綜合試驗過程與結果，以總二氧化硫作為評價指標，依據表1進行四因素三水平正交試驗，用SPSS和正交助手軟件對結果進行分析，結果見表3。

表3 葡萄酒中二氧化硫去除效果正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal experiment for SO2removal in wine

由表3可知，試驗5效果最佳，其總二氧化硫清除率最高，試驗5與試驗4和6差異顯著，與其他試驗小組比較差異極顯著。由試驗結果的極差值可知，本試驗的影響因素菠菜提取物用量＞處理時間＞pH值＞乙醇濃度，其中菠菜提取物用量因素對試驗結果的影響最大，其中菠菜提取物用量0.4 mg/mL時的效果最好。

本研究對正交試驗結果進行了驗證，取菠菜提取物用量0.4 mg/mL、處理時間6 min、pH3.5（葡萄酒正常的pH值）、乙醇濃度12.5%（葡萄酒正常的乙醇濃度），總二氧化硫去除率為94.36%，與正交試驗結果無明顯差異。

2.6 菠菜提取物用量對葡萄酒感官的影響

按照100分葡萄酒感官評分原則，對去除二氧化硫后的葡萄酒進行品評，結果見表4。

表4 葡萄酒感官品評結果Table 4 Sensory evaluation results of wine

由表4可以看出，去二氧化硫的葡萄酒在感官品評方面要好于未處理的葡萄酒，品評人員明顯感覺，經去二氧化硫后的葡萄酒幾乎聞不到硫臭味，而且入口后整體協調性也明顯好于未處理的葡萄酒。

3 結論

葡萄酒中添加二氧化硫是人類長期實踐的結果，但是對于一些二氧化硫敏感患者來說，葡萄酒中的二氧化硫則是非常危險的。目前已報道的葡萄酒除硫技術不但過程復雜，而且嚴重影響葡萄酒的質量。本研究研制的菠菜提取物技術，具有許多優(yōu)點，如操作簡單，使用量少，除硫速度快，效率高，同時不受pH值的影響，除硫后的葡萄酒口感明顯優(yōu)于處理前的產品，因此，本研究的成果，將為無硫葡萄酒的研制提供理論上的支撐。