楊博睿，張富新，邵玉宇，蔡俊娜，劉坤鈺

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安710119）

0 引 言

乳中富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)、維生素和多種生物活性成分，是人體攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源[1]。目前人們可利用的乳類已有10 多種[2]，其中牛乳由于營(yíng)養(yǎng)全面、產(chǎn)量大，已成為人們消費(fèi)的主要乳類，約占乳類消費(fèi)的85%[3]。隨著人們對(duì)乳類需求的多元化及營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的提高，一些特種乳及乳制品越來(lái)越受到人們的關(guān)注，羊乳作為僅次于牛乳的第二大乳類，其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)保健功能已被人們認(rèn)識(shí)[4]。此外，人乳作為營(yíng)養(yǎng)及功能最完美的乳類，其復(fù)雜的化學(xué)組成及獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)功能，已在人類營(yíng)養(yǎng)界受到高度關(guān)注[5]。乳蛋白質(zhì)是人們從乳中攝取的最主要的營(yíng)養(yǎng)素，主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，但其組成及含量在不同來(lái)源乳類之間有較大差別[6]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)牛乳和人乳中蛋白質(zhì)組成及消化利用研究較多[7-8]，在羊乳的消化特性方面也有一些報(bào)道[9]，但在系統(tǒng)比較牛乳、羊乳和人乳蛋白質(zhì)組成及消化特性方面報(bào)道極少。因此本文在分析牛乳、羊乳和人乳中蛋白質(zhì)組成的基礎(chǔ)上，利用體外模擬胃腸消化，研究牛乳、羊乳和人乳的消化特性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)牛乳、羊乳提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羊乳采自西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)350 只西農(nóng)薩能奶山羊混合奶樣；牛乳采自西安銀橋乳業(yè)集團(tuán)農(nóng)場(chǎng)的300 頭黑白花奶?；旌夏虡?；人乳采自西安市3名健康母親3 個(gè)月內(nèi)的乳汁，采樣后混合均勻；乳樣采集后在-40 °C 下貯存。

1.2 試劑

胃蛋白酶(活性 3 000～3 500 u)，美國(guó) Sigma 公司；胰酶（活性1 750 u），美國(guó)Sigma 公司；豬膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，Solarbio 公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（4 X）、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（14.4～116 ku），碧云天生物技術(shù)有限公司；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；溴甲酚綠指示劑、甲基紅指示劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉，洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；乙醇、甲醇、冰乙酸，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鈉、無(wú)水氯化鈣、硼酸、五水硫酸銅，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

Kjeltec 全自動(dòng)凱式定氮儀，瑞典福斯(Foss)公司；BSA22025 型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FM 恒溫水浴鍋，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VORTEX-5 旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C 型精密pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B 型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Power PacTM 基礎(chǔ)電泳儀電源和Mini-Protean Tetra Cell 電泳槽，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；THZ-300/300C 型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ChemiDoc-it System 510 Imager化學(xué)發(fā)光成像儀，美國(guó)UVP 公司；DN-12 氮吹儀，上海比朗儀器有限公司。

1.4 乳蛋白質(zhì)的分離及測(cè)定

乳蛋白質(zhì)的分離參照GB/T 21704-2008[10]的方法。取100 mL 冷凍乳樣在室溫下自然解凍，然后在3 000 g 下離心 15 min 脫脂，得到脫脂乳。取 10 mL 脫脂乳用1 mol/L HCI 調(diào)整 pH 至等電點(diǎn)（牛乳4.6[11]，羊乳4.2[12]，人乳4.6[13]），室溫下靜置30 min后，在10 000 g下離心20 min，重復(fù)兩次，得到沉淀部分為酪蛋白部分，上清液為非酪蛋白部分。取10 mL 非酪蛋白部分，加入15%三氯乙酸（質(zhì)量濃度），使三氯乙酸最終濃度為12%，在3 500 g 下離心20 min，沉淀為乳清蛋白部分，上清液為非蛋白氮部分。樣品總氮、非蛋白氮、非酪蛋白氮分別用自動(dòng)凱式定氮儀測(cè)定[14]。按下面公式計(jì)算：

總蛋白=（總氮-非蛋白氮）×6.38

酪蛋白=（總氮-非蛋白氮）×6.38

乳清蛋白=（非酪蛋白氮-非蛋白氮）×6.38

1.5 體外模擬消化

乳樣在室溫下自然解凍后在3 500 g 下離心脫脂。取脫脂乳進(jìn)行體外模擬胃液消化、腸液消化、胃腸液消化。

體外模擬胃液消化參照Pan[15]和Alison[16]方法。取 10 mL 脫脂乳于 37 °C 下預(yù)熱 5 min，添加 10 mL 人工胃液（2 g NaCI 和7 mL 2 mol/L HCI 配制成1 L），用2 mol/L HCI 將乳樣的pH 調(diào)整為2.0，添加0.03 g胃蛋白酶混合均勻后于37 °C 恒溫水浴中消化30 min、60 min、120 min，然后用1 mol/L NaOH 調(diào)整液消化pH 至7.0 終止反應(yīng)，取消化液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

體外模擬腸液消化參照Miriam[17]和Hyeong[18]方法。取10 mL脫脂乳于37 °C下預(yù)熱5 min，添加0.1 mL人工腸液（68.3 mL NaHCO3(84.7 g/L)、10 mL CaCl2·2H2O(22.2 g/L)和30 g膽鹽配制成500 mL），用1 mol/L NaOH 將乳樣的 pH 調(diào)整為 7.0，添加 0.005 g 胰酶（活性1750 U/mg）混合均勻后于37°C 恒溫水浴中分別消化 2 min、10 min、30 min，取消化液進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳。

體外模擬胃腸液消化參照體Alison[16]和Miriam[17]方法。取 10 mL 脫脂乳于 37 °C 下預(yù)熱 5 min，添加10 mL 人工胃液（2 g NaCI 和 7 mL2 mol/L HCI 配制成1 L），用2 mol/L HCI 將乳樣的pH 調(diào)整為2.0，添加0.03 g 胃蛋白酶混合均勻后于37 °C 恒溫水浴中消化30 min，然后取出乳樣添加0.1 mL 人工腸液[68.3 mL NaHCO3(84.7 g/L)、10 mL CaCl2·2H2O(22.2 g/L)和30 g 膽鹽配制成 500 mL]，用 1mol/L NaOH 將乳樣的pH 調(diào)整為7.0，添加0.005 g 胰酶（1750 U/mg）混合均勻后于37 °C恒溫水浴中分別消化2 min、10 min、30 min，在沸水浴中煮沸5 min 終止反應(yīng)，取消化液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6 SDS-PAGE凝膠電泳

參照Neuhoff[19]的方法。將13.5%的分離膠（2.25 mL 30%丙烯酰胺、1.25 mL pH 8.8 三（羥甲基）氨基甲烷（tris-HCl）、50 μL 10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、50 μL 10%-過(guò)硫酸銨（APS）、5 μL 四甲基乙二胺（TEMED）和1.4 mL超純水）注入凝膠板中凝膠40 min，再將3.75%濃縮膠（0.313 mL 30%丙烯酰胺、0.313 mL pH 6.8 tris-HCl、25 μL 10% SDS、37.5 μL 10% APS、3.75 μL TEMED和1.813 mL 超純水）注入凝膠板凝膠40 min，完成制膠階段。在電泳槽內(nèi)加入電極緩沖液（3.03 g tris、18.7 g 甘氨酸、1 g SDS 定容至 1 L）。將牛乳和羊乳樣品用超純水稀釋10 倍，人乳樣品用超純水稀釋5 倍，取 30 μL 乳樣稀釋液加入 10 μL 蛋白上樣緩沖液（上樣緩沖液∶乳樣稀釋液=1∶3），在沸水浴中加熱5 min 使蛋白質(zhì)變性。取7 μL 處理后的樣品上樣，開(kāi)始電泳電壓為75 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至200 V，電泳40 min。將凝膠從凝膠板上取下，在水平搖床中用染色液（1 g 考馬斯亮藍(lán) R-250、450 mL 甲醇、100 mL 冰乙酸定容至1 L）染色2 h。然后用脫色液（甲醇∶冰乙酸∶超純水的比例為1∶1∶8）搖床脫色至蛋白條帶清晰為止，最后用Chemi Doc-It 化學(xué)成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行灰度分析。

1.7 乳蛋白殘留率和消化率

用化學(xué)發(fā)光成像儀對(duì)SDS-PAGE電泳條帶的灰度值進(jìn)行測(cè)定，然后按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)的殘留率[16]和消化率[20]：

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin9.1 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和圖表編輯；采用DPS 9.50 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳、羊乳和人乳中含氮物質(zhì)和蛋白質(zhì)組成

2.1.1 牛乳、羊乳和人乳中含氮物質(zhì)

牛乳、羊乳和人乳中含氮物質(zhì)主要由酪蛋白氮(Casein Protein Nitrogen，CPN)、乳清蛋白氮（Whey Protein Nitrogen，WPN）和非蛋白氮（Non-Protein Nitrogen，NPN）組成，其含量見(jiàn)表1。

表1 牛乳、羊乳和人乳的含氮物質(zhì)組成

由表1 可以看出，牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白氮有顯著差別（P<0.05），牛乳中酪蛋白氮含量最高，而人乳中含量最低；牛乳與羊乳中乳清蛋白氮無(wú)顯著性差異（P>0.05），而人乳中含有較高的乳清蛋白氮；牛乳、羊乳和人乳中非蛋白氮也有較大差別，牛乳中非蛋白氮含量最低，而人乳中非蛋白氮含量最高。同時(shí)，從牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白和乳清蛋白含量也可以看出，牛乳中酪蛋白含量最高，人乳中酪蛋白含量最低，牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白與乳清蛋白的比值分別為4.45，3.65 和0.51，這表明牛乳中蛋白質(zhì)主要由酪蛋白組成，人乳中蛋白質(zhì)主要由乳清蛋白組成，羊乳中酪蛋白與乳清蛋白之比更接近于人乳。

2.1.2 牛乳、羊乳和人乳中蛋白質(zhì)組成

乳中的蛋白質(zhì)主要由酪蛋白和乳清蛋白組成。酪蛋白主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4 種酪蛋白組成，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白組成。

圖1 牛乳、羊乳和人乳的蛋白質(zhì)電泳圖

由圖1 可見(jiàn)，牛乳、羊乳和人乳中蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 電泳中條帶分離清晰，牛乳和羊乳中酪蛋白可清晰觀察到αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4 種酪蛋白條帶，而人乳中僅可觀察到β-酪蛋白和κ-酪蛋白條帶，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白條帶，這與Maria 的報(bào)道一致[21]。同時(shí)，牛乳和羊乳中還可以觀察到α-乳白蛋白和β-乳球蛋白2 種乳清蛋白條帶，而在人乳中僅含有α-乳白蛋白條帶，無(wú)β-乳球蛋白條帶。除了4 種酪蛋白和2 種乳清蛋白外，電泳中還可觀察到乳鐵蛋白、血清白蛋白及免疫球蛋白條帶，尤其是人乳中含有較高的乳鐵蛋白和血清白蛋白。通過(guò)對(duì)SDS-PAGE 凝膠電泳條帶灰度分析（見(jiàn)表2），發(fā)現(xiàn)牛乳、羊乳和人乳中4 種酪蛋白和2 種乳清蛋白含量有明顯差別，在酪蛋白組成方面，牛乳中αs1-酪蛋白含量顯著高于羊乳（P<0.05），而羊乳中αs2-酪蛋白含量高于牛乳（P<0.05），人乳中β-酪蛋白含量最高，顯著高于牛乳和羊乳（P<0.05），同時(shí)人乳中的κ-酪蛋白也顯著高于牛乳和羊乳（P<0.05）。這表明牛乳中酪蛋白主要由αs1-酪蛋白和β-酪蛋白組成，羊乳中酪蛋白主要由αs2-酪蛋白和β-酪蛋白組成，而人乳中酪蛋白主要由β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。從乳清蛋白組成看，人乳中α-乳白蛋白含量顯著高于牛乳和羊乳（P<0.05），牛乳中β-乳球蛋白含量顯著高于羊乳和人乳（P<0.05），表明牛乳中乳清蛋白主要由β-乳球蛋白組成，人乳中乳清蛋白主要由α-乳白蛋白組成，而羊乳中β-乳球蛋白含量低于牛乳。大量研究表明，乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白是引起蛋白質(zhì)過(guò)敏反應(yīng)的來(lái)源[22],人乳中幾乎不含αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，與牛乳相比，羊乳中含有較低的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，這也是羊乳不易引起蛋白質(zhì)過(guò)敏的主要原因。

表2 牛乳、羊乳和人乳的蛋白質(zhì)組成

2.2 牛乳、羊乳和人乳中蛋白質(zhì)的消化特性

2.2.1 牛乳、羊乳和人乳中蛋白質(zhì)的胃液消化

牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)在胃液中消化電泳圖見(jiàn)圖2。由圖2 可見(jiàn)，牛乳、羊乳和人乳在整個(gè)胃液消化期間，酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)條帶逐漸變暗，尤其在胃液消化120 min 時(shí)，牛乳酪蛋白條帶逐漸消失，羊乳僅有少量的酪蛋白條帶，人乳在消化60 min 時(shí)，酪蛋白條帶也逐漸消失。由于降解產(chǎn)物的形成，使乳清蛋白（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）條帶亮度有逐漸增加的趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)電泳條帶灰度掃描發(fā)現(xiàn)，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)在整個(gè)胃液消化期間，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，高分子量蛋白（MW>40）和酪蛋白的殘留率逐漸減少，而低分子量蛋白（MW<20）的殘留率逐漸增大（見(jiàn)表3），表明隨著胃液消化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的消化率逐漸提高。通過(guò)對(duì)牛乳、羊乳和人乳比較發(fā)現(xiàn)，在消化120 min 時(shí)牛乳高分子量蛋白（MW>40）殘留率最低，羊乳和人乳無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明牛乳中高分子量蛋白（MW>40）比羊乳和人乳更易消化。從酪蛋白殘留率看，整個(gè)消化期間，牛乳中酪蛋白殘留率最高（P<0.05），人乳中酪蛋白殘留率最低（P<0.05），表明人乳中酪蛋白在胃液中最易消化，羊乳中酪蛋白比牛乳中酪蛋白更易消化。從牛乳、羊乳和人乳中酪蛋白組分消化可以看出（見(jiàn)表4），牛乳和羊乳中αs1-酪蛋白在胃液消化120 min 時(shí)消化率無(wú)顯著差別（P>0.05），而αs2-酪蛋白在整個(gè)消化期間牛乳消化率顯著高于羊乳（P<0.05），β-酪蛋白和κ-酪蛋白在整個(gè)消化期間人乳顯著高于牛乳和羊乳（P<0.05），而羊乳高于牛乳（P<0.05），這表明人乳中僅有的β-酪蛋白和κ-酪蛋白在胃液消化中最易消化，與牛乳相比，羊乳中酪蛋白在胃液消化中更易消化。

圖2 牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)模擬胃消化電泳圖

表3 牛乳、羊乳和人乳在胃液消化中蛋白質(zhì)的殘留率 %

表4 牛乳、羊乳和人乳在胃液消化中酪蛋白的消化率 %

2.2.2 牛乳、羊乳和人乳中蛋白質(zhì)的的腸液消化

牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)在腸液中消化電泳圖見(jiàn)圖3。由圖3 可見(jiàn)，牛乳、羊乳和人乳在整個(gè)腸液消化期間，酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)條帶逐漸變暗，人乳在消化2 min 時(shí)，酪蛋白條帶也逐漸消失，牛乳和羊乳在腸液消化10 min時(shí)，酪蛋白條帶也逐漸消失，表明人乳酪蛋白在腸液中比牛羊乳更易消化。通過(guò)對(duì)電泳條帶灰度掃描發(fā)現(xiàn)，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)在整個(gè)腸液消化期間，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，高分子量蛋白（MW>40）和酪蛋白的殘留率逐漸減少，而低分子量蛋白（MW<20）的殘留率有逐漸增加的趨勢(shì)（見(jiàn)表5），這表明隨著腸液消化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的消化率逐漸提高。通過(guò)對(duì)牛乳、羊乳和人乳比較發(fā)現(xiàn)，在腸液消化30 min時(shí)牛乳高分子量蛋白（MW>40）殘留率最低，羊乳和人乳無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明牛乳中高分子量蛋白（MW>40）比羊乳和人乳更易消化。從酪蛋白殘留率看，整個(gè)消化期間，牛乳中酪蛋白殘留率最高（P<0.05），人乳中酪蛋白殘留率高于羊乳（P<0.05）,表明人乳中酪蛋白在腸液中最易消化，羊乳中酪蛋白比牛乳中酪蛋白更易消化。從低分子量蛋白（MW<20）殘留率來(lái)看，牛乳、羊乳和人乳的低分子量蛋白（MW<20）殘留率隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)了先增高后降低的趨勢(shì)，這表明高分子量蛋白和酪蛋白基本消化完全后，低分子量蛋白也逐漸被消化。除此之外，與胃液消化相比，牛乳、羊乳和人乳在腸液中消化10 min 時(shí)，90%以上的酪蛋白已消化，消化30 min時(shí)，酪蛋白幾乎完全消化，表明乳蛋白主要在小腸內(nèi)消化吸收，這與Alison[16]、Jasinska[23]等的報(bào)道基本一致。

2.2.3 牛乳、羊乳、人乳中蛋白質(zhì)的胃腸液消化

圖3 牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)模擬腸消化電泳圖

表5 牛乳、羊乳和人乳在腸液消化中蛋白質(zhì)的殘留率 %

圖4 牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)模擬胃腸消化電泳圖

牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)在胃腸液中消化電泳圖見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，牛乳、羊乳和人乳在整個(gè)胃腸液消化期間，酪蛋白條帶逐漸變暗，尤其在消化10 min時(shí)，牛乳和羊乳酪蛋白條帶逐漸消失，人乳在消化2 min 時(shí)，酪蛋白條帶也逐漸消失。隨著降解產(chǎn)物的形成和消化時(shí)間的延長(zhǎng)，乳清蛋白條帶亮度也逐漸減少。通過(guò)對(duì)電泳條帶灰度掃描發(fā)現(xiàn)，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)在整個(gè)消化期間，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，高分子量蛋白（MW>40）、酪蛋白和低分子量蛋白（MW<20）的殘留率逐漸減少（見(jiàn)表6），表明隨著胃腸液消化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的消化率逐漸提高。通過(guò)對(duì)牛乳、羊乳和人乳比較發(fā)現(xiàn)，在消化30 min 時(shí)牛乳高分子量蛋白（MW>40）殘留率最低，羊乳和人乳無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明牛乳中高分子量蛋白（MW>40）比羊乳和人乳更易消化。從酪蛋白殘留率看，整個(gè)消化期間，牛乳中酪蛋白殘留率最高（P<0.05），人乳中酪蛋白殘留率最低（P<0.05），表明人乳中酪蛋白在胃腸液中最易消化，羊乳中酪蛋白比牛乳中酪蛋白更易消化。

表6 牛乳、羊乳和人乳在胃腸液消化中蛋白質(zhì)的殘留率 %

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)組成及消化特性研究發(fā)現(xiàn)，牛乳、羊乳和人乳中的蛋白質(zhì)有較大差別，牛乳中酪蛋白質(zhì)主要由αs1-酪蛋白和β-酪蛋白組成，羊乳中酪蛋白主要由αs2-酪蛋白和β-酪蛋白組成，人乳中酪蛋白主要由β-酪蛋白組成。牛乳和羊乳中乳清蛋白主要是β-乳球蛋白，而人乳中乳清蛋白主要是α-乳白蛋白。模擬成人胃腸消化表明，乳蛋白主要在腸中消化，人乳中蛋白質(zhì)在胃腸中最易消化，而羊乳比牛乳更易消化，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用牛乳和羊乳提供基礎(chǔ)。