陳秀芬，梁穎思，黃家欣，周露

（廣東省食品檢驗所，廣州510435）

0 引 言

維生素B12的檢測方法主要有微生物法、化學分析法和試劑盒法[1-3]。微生物法靈敏度和準確度較高[4]，所以公職分析化學家協(xié)會(AOAC)[5]和美國藥典(USP)[6]以及中國國家標準[7]都將該方法作為檢測的主要方法和仲裁方法[8]，但檢測步驟繁瑣、檢測周期長和易受干擾[9]；化學分析法相對快速簡單，但存在錯測漏測和易受干擾的可能[10]；試劑盒法基于微生物法原理，步驟簡單，檢測周期短，結(jié)果準確性較高。

實驗室間比對是按照預先規(guī)定的條件，由兩個或多個實驗室對檢測物品進行檢測的組織、實施和評價[11]，并對內(nèi)部質(zhì)量控制活動進行監(jiān)控，確保檢測結(jié)果的質(zhì)量[12]。因此，本實驗室與廣州市食品檢驗所對嬰幼兒乳粉中維生素B12進行實驗室間比對實驗，比對結(jié)果滿意。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

廣州市食品檢驗所發(fā)放的一包約30 g 比對樣品奶粉，包裝為塑料密封袋，完好無破損。

菌種：萊士曼氏乳桿菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830（美國Microbiologics公司）。

試劑：乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、維生素B12試劑盒（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；維生素B12試劑盒（德國拜發(fā)公司）；維生素B12測定用培養(yǎng)基（美國BD 公司）；維生素B12標準品（編號CCFD200070，純度為99.6%，購于CATO Reseach Chemicals Inc.）；水磷酸氫二鈉，廣州化學試劑廠；無水偏重亞硫酸鈉，上海麥克林生化有限公司；一水檸檬酸，天津市福晨化學試劑廠。

FE 型 pH 計，梅特勒-托利多集團；Allegra64R 型離心機，美國 Beckman Coulter；UV-2600 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；SX-700 型高壓滅菌器，日本TOMY 公司；AC2-4S1 型生物安全柜，新加坡ESCO 公司；SW-CJ-2F 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；800-TS 型酶標儀，美國BioTek 公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物法[7]

（1）測試菌懸液的制備。將活化后的萊士曼氏乳桿菌接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)液以 2 000～3 000 r/min 離心 2～3 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，混勻，重復以上步驟3 次，再加10 mL 生理鹽水，混勻吸適量該菌懸液于10 mL生理鹽水中，混勻制成測試菌懸液。

以生理鹽水做空白，于550 nm 波長下測測試菌液的透光率，用生理鹽水或菌液調(diào)整透光率至60%～80%之間。

（2）前處理液的制備。稱取無水磷酸氫二鈉1.3 g，無水偏重亞硫酸鈉1.0 g，一水檸檬酸1.2 g，用100 mL水溶解。

（3）樣品的前處理。稱取約6 g 樣品于250 mL 錐形瓶中，用10 mL 前處理混合后，再加150 mL 水，與121 ℃水解10 min，冷卻后調(diào)pH值至4.5±0.2，再用水定容至250 mL，過濾。移取濾液5 mL，加入水20～30 mL。調(diào)pH 值至6.8±0.2，用水定容至100 mL。

（4）維生素B12標準曲線的制作。按表1 順序加入水、標準曲線工作液和維生素B12測定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中，一式三份。

表1 標準曲線的制作 mL

（5）樣品的制作。按表2 順序加水、樣品溶液和維生素B12測定培養(yǎng)基于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。

表2 待測液的制作 mL

（6）滅菌、培養(yǎng)和測定。將所有標準試樣管和樣品管121 ℃滅菌5 min。再將上述試管迅速冷卻至30 ℃以下，并向各試管滴加1 滴（50 μg）測試菌液（標準曲線管中空白S1 除外），放入恒溫培養(yǎng)箱36 ℃±1 ℃培養(yǎng)19～20 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在波長550 nm 下，測定每支試管的吸光度。

1.2.2 試劑盒法（進口與國產(chǎn)）

進口試劑盒和國產(chǎn)試劑盒按照說明書操作。

（1）樣品的前處理。試劑盒法（進口）稱取1 g（精確至0.0001 g）樣品溶入40 mL 蒸餾水中，試劑盒法（國產(chǎn)）稱取1 g（精確至0.01 g）樣品溶入20 mL 樣品處理液（維生素B12保護液與蒸餾水比例為1:50）中，搖勻。95 ℃水浴30 min，期間每5 min 振蕩一次 ，然后迅速冷卻至室溫，并用0.2 μm 無菌濾膜過濾至無菌離心管中。將無菌濾液稀釋備用。

（2）培養(yǎng)基制備。在含有培養(yǎng)基的玻璃瓶中加入10 mL 無菌水，95 ℃ 水浴 5 min，期間每 2 min 振蕩一次，然后迅速冷卻至室溫，并用0.22 μm 無菌濾膜過濾至無菌離心管中備用。其中，試劑盒法（國產(chǎn)）需將維生素B12檢測菌球溶解于培養(yǎng)基中，振蕩，搖勻。

（3）標準品溶液的制備。試劑盒法（進口）：在維生素B12標準瓶中加入2.4 mL 無菌水，搖勻。取6 個無菌管按照表3 配置（0.03～0.18）μg/100 g 系列濃度的標準溶液。

表3 標準曲線稀釋質(zhì)量分數(shù)

試劑盒法（國產(chǎn)）：在維生素B12標準瓶中加入5 mL 標準品稀釋液（維生素B12保護液與1×維生素B12緩沖液比例為1:50），搖勻。取8 個無菌管按照表4 配置0.02～0.16 μg/100 g系列濃度的標準溶液。

表4 標準曲線稀釋質(zhì)量分數(shù)

（4）上板培養(yǎng)。取相應數(shù)量的微孔板條至板架，試劑盒法（進口）加入150 μL 培養(yǎng)基和150 μL 標準品或樣品，試劑盒法（國產(chǎn)）加入100 μL 培養(yǎng)基和100 μL標準品或樣品，再用密封膠片將所有微孔密封，37 ℃黑暗條件下培養(yǎng)44～48 h。

（5）讀數(shù)及結(jié)果分析。孵育完畢后，將微孔板倒置并振蕩搖勻，揭去粘合箔并去除微孔液體表面的氣泡，用酶標儀在630 nm 或540 nm 條件下讀數(shù)。結(jié)果分析時使用ELISA 專業(yè)統(tǒng)計分析軟件中4-Parameter計算方法對結(jié)果進行分析。

1.2.3 質(zhì)量控制措施

為保證檢測數(shù)據(jù)的準確性和可信度, 本次實驗室間比對根據(jù)試樣C00076 中B12含量水平、方法選擇以及實驗室條件, 對B12的測定采用以下質(zhì)量控制措施:平行實驗、加標回收實驗、質(zhì)控樣品實驗、實驗室間比對和方法比對。質(zhì)量控制措施的具體內(nèi)容如下:

（1）平行實驗。采用2 平行，即稱取2 份樣品，在重復性條件下獲得兩次獨立測定結(jié)果，計算平行結(jié)果的相對標準偏差（Reative Standard Deviation，RSD），分析測定結(jié)果的精密度。

（2）加標回收實驗。在試樣C00076 中加入已知濃度的維生素B12標準工作液，加標量為50 ng，計算加標回收率，分析測定結(jié)果的準確度。

（3）質(zhì)控樣品實驗。選用購自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心的含B12嬰兒配方乳粉作為質(zhì)控樣品進行實驗，分析實驗過程的質(zhì)量控制。

（4）實驗室間比對。與廣東省廣州市食品檢驗所對微生物法進行實驗室間比對，在再現(xiàn)性條件下獲得測定結(jié)果，計算再現(xiàn)性標準差（Reproducibility Stan?dard Deviation），檢驗實驗過程的可信度。

（5）方法比對。采用微生物法和試劑盒法進行方法比對，分析測定結(jié)果受試驗方法差異的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性分析結(jié)果

分別用微生物法和試劑盒法（分別包括進口試劑盒和國產(chǎn)試劑盒）對試樣C00076 進行測定，以維生素B12含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，根據(jù)四參數(shù)方程擬合標準曲線，3 種方法標準曲線如圖1～圖3 所示，其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表5 所示。 由表5 可知，微生物法所得標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9151，試劑盒法（進口）為0.9995，試劑盒法（國產(chǎn)）為0.9979，可知試劑盒法（進口試劑盒）的線性關(guān)系更好。

圖1 微生物法維生素B12標準曲線

2.2 精密度實驗結(jié)果

稱取6 份試樣C00076 按照上述實驗方案進行分析，測定結(jié)果如表6所示。微生物法和試劑盒法（進口和國產(chǎn)）的測定結(jié)果的RSD分別為5.92%、4.00%和8.00%，RSD均小于10%，滿足GB5413.14-2010的要求[8]。

圖2 試劑盒法（進口）維生素B12標準曲線

圖3 試劑盒法（國產(chǎn)）維生素B12標準曲線

表5 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限 μg/100g

表6 精密度實驗結(jié)果 μg/100g

2.3 加標回收實驗結(jié)果

稱取試樣C00076，加入0.5 mL 濃度為100 ng/mL的維生素B12標準溶液，微生物法和試劑盒法（進口和國產(chǎn)）的測定結(jié)果的加標回收率如表7 所示，參照GB/T 27404-2008 附錄F，回收率均在80%～110%范圍內(nèi)，均符合要求。

表7 加標回收實驗結(jié)果

2.4 質(zhì)控樣品實驗結(jié)果

稱取質(zhì)控樣品QC17038 與待測試樣C00076 同時進行前處理，再各自按照上述實驗方案進行實驗，質(zhì)控樣品的實驗結(jié)果如表8 所示。由表8 可以看出，微生物法和試劑盒法（進口和國產(chǎn)）檢測出的質(zhì)控樣品結(jié)果均在滿意值范圍內(nèi)，說明所選擇的檢測方法合適，檢測結(jié)果可靠。

表8 質(zhì)控樣品實驗結(jié)果 μg/100g

2.5 實驗室間比對結(jié)果

本實驗室與廣東省廣州市食品檢驗所采用微生物法進行實驗室間比對，結(jié)果如表9 所示。由表9 可以看出，本實驗室與廣東省廣州市食品檢驗所維生素B12報告值得再現(xiàn)性標準差為0，表明比對結(jié)果滿意。

表9 實驗室間比對結(jié)果 μg/100g

2.6 微生物法和試劑盒方法比較

本次實驗維生素B12微生物法檢測值（1.7 μg/100 g）比試劑盒法檢測值高（進口為1.0 μg/100 g；國產(chǎn)為0.8 μg/100 g）（表6），可知，微生物法比試劑盒法（進口和國產(chǎn)）的結(jié)果都高。微生物法與試劑盒法（進口）的報告值相對偏差為51.9%，加標回收率相對偏差為3.27%；微生物法與試劑盒法（國產(chǎn)）的報告值相對偏差為72.0%，加標回收率相對偏差為19.2%；試劑盒法（進口）與試劑盒法（國產(chǎn)）的報告值相對偏差為11.1%，加標回收率相對偏差為16.0%。方法比對的報告值相對偏差均大于10%，表明測定結(jié)果受到實驗方法差異的影響較大。有學者研究表明，商品化試劑盒法線性關(guān)系良好、人員比對重復性良好[13]和減少了洗滌污染等問題，但是使用試劑盒需要進行評價和方法確認[14]。另外，試劑盒法檢測維生素B12的結(jié)果顯著低于國標法結(jié)果[15-16]，GB 5413.14-2010[7]中試樣提取過程用到的偏重亞硫酸鈉能使不穩(wěn)定的鈷胺素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的氰鈷胺素或者亞硫酸合鈷胺素，利于維生素B12提取，而商品化試劑盒一般采用蒸餾水提取維生素B12，可能使得樣品中維生素B12提取不徹底，進而導致檢測結(jié)果低于實際值，且但僅能檢測添加的維生素B12，或者也可采用氰化物作為提取液，但氰化物是劇毒，不易獲得也不適于長期檢測。因此，應盡量避免采用試劑盒法檢測食品中的天然維生素B12質(zhì)量分數(shù)較高的食品或者檢測強化和天然維生素B12總和的食品。

3 結(jié) 論

本次實驗室間比對，對試樣C00076 的維生素B12質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果為1.7 μg/100 g，與廣州市食品檢驗所進行比對，結(jié)果滿意。

微生物法檢測維生素B12雖然操作步驟繁瑣、實驗周期長和受外部影響大，但是準確度和靈敏度較高，關(guān)鍵在于控制好接種菌的活力和數(shù)量、實驗玻璃器具除雜、樣品前處理的pH 值變化范圍、培養(yǎng)基和嚴格無菌操作。為了提高檢測效率和準確度，可以參考試劑盒法的實驗方法來對現(xiàn)有的微生物法進行改進：（1）實驗全程采用一次性無菌塑料試管和容器，或者將玻璃儀器專項專用放置，每一次實驗完畢后都采用熱肥皂水浸泡清洗、180 ℃，3 h 干燥除雜處理；（2）參考樣品快速前處理方法, 從而縮短前處理時間；（3）將培養(yǎng)基和樣品進行過濾操作，減少對干擾吸光度的因素；（4）將實驗菌株預先制成凍干粉或者制成甘油管于液氮或-80 ℃冰箱中更易于保存，實驗時再用植物乳桿菌肉湯復蘇、連續(xù)傳代2～3 代后使用另外有研究將萊士曼氏乳桿菌按標準制成接種液，再與甘油混勻分裝凍存于-80 ℃冰箱，接種液可隨時使用，避免實驗前耗費4～5 d 制備菌液, 實現(xiàn)來樣當天檢測, 縮短檢測周期和節(jié)約成本[17]；（4）采用空白無菌微孔板代替試管培養(yǎng)，酶標儀代替紫外可見分光光度計測出吸光度，ELISA 專業(yè)統(tǒng)計分析軟件中4-Parameter 計算方法代替中國國家標準GB 5413.14-2010[7]中的繁瑣計算，從而提升檢測效率。將測定維生素B12質(zhì)量分數(shù)的微生物方法進行改進，可以較大程度的縮短了檢測時間和降低試驗成本[18]，有利于建立高效實驗流程和加強實驗室質(zhì)量管理，保證結(jié)果的有效性和準確度，加強微生物法在實驗室間的推廣。