馬曉娟謝有發(fā)劉文君喬培鐘地長(zhǎng)李詒光余銀芳

（江中藥業(yè)股份有限公司，南昌，330096）

0 引 言

乳酸是乳酸菌發(fā)酵中的主要代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式為CH3CHOHCOOH，由于分子內(nèi)含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光異構(gòu)現(xiàn)象，可區(qū)分為L(zhǎng)-乳酸和D-乳酸，當(dāng)兩者以等比例混合時(shí)，即成為內(nèi)消旋的DL-乳酸。由于人體只含有L-乳酸脫氫酶，從而能分解自體產(chǎn)生的或攝入的L-乳酸，不能代謝D-乳酸[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）明確規(guī)定，人體每天攝取D-乳酸的量限定在100 mg/kg 體重以下，而對(duì)L-乳酸不加限制[2]。目前研究食品與藥品中的L-乳酸、D-乳酸的報(bào)道較多，食品中多為發(fā)酵制品，如白酒[3]、酸奶[4-5]、乳酸飲料[5]、泡菜[6]等，藥品中有醋酸奧曲肽注射劑[7]、左氧氟沙星[8]、乳酸菌素原料制劑[9]等，關(guān)于L-乳酸、D-乳酸的測(cè)定，已經(jīng)建立的分析方法主要有4種:滴定法、旋光法、UV 酶法分析、酶電極法和液相色譜法[10]。

短鏈脂肪酸通常是指碳鏈中碳原子數(shù)少于6 的有機(jī)脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸等[11]。短鏈脂肪酸是乳酸發(fā)酵的代謝物之一，能改善一些金屬離子如鈣、鐵、鎂的代謝和吸收，對(duì)胃黏膜有一定的保護(hù)作用，也能改善乳制品的風(fēng)味[12-13]。短鏈脂肪酸被吸收后，在各種器官中被利用，在調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝方面起重要作用[14]。目前，氣質(zhì)聯(lián)用法用于檢測(cè)短鏈脂肪酸較為廣泛，曾鱗粞[15]用GC-MS 分別對(duì)生物組織、糞便、血液等對(duì)短鏈脂肪酸進(jìn)行了分析，龐錦偉等[16]用GC-MS 對(duì)酵素產(chǎn)品中的5種短鏈脂肪酸進(jìn)行了測(cè)定。乳酸菌素原料是由嗜酸乳桿菌發(fā)酵脫脂奶粉而成的粉末，其中乳酸及短鏈脂肪酸是主要代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平較低，質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單，其中總酸量通過酸堿滴定法測(cè)定，沒有較為詳細(xì)的指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)參考白璧煒的檢測(cè)方法[9]及國(guó)標(biāo)方法[17],采用高效液相色譜法對(duì)乳酸菌素原料中的L-乳酸、D-乳酸進(jìn)行分離與測(cè)定，采用氣質(zhì)聯(lián)用法[18-20]對(duì)原料中的7 種短鏈脂肪酸進(jìn)行測(cè)定，用較為先進(jìn)的技術(shù)對(duì)原料進(jìn)行質(zhì)量分析，為選擇原料提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 樣品與試劑

乳酸菌素原料，分別由A、B、C 原料廠家提供；L-乳酸對(duì)照品（≥98%）、D-乳酸對(duì)照品（≥90%），德國(guó)默克生命科學(xué)有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸（均為色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Agilent 7890A-7000D 氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；sartorius MS204S/01 電子天平，德國(guó)Sartorius 賽多利斯公司；sartorius MS6.6S-CE 電子天平，德國(guó)Sartorius賽多利斯公司；IQ 7000 超純水儀，廈門精益興業(yè)科技有限公司；KQ-1000KDE 超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；GL-20G-II 低溫高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方法與測(cè)定

2.1 L-乳酸與D-乳酸的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取L-乳酸對(duì)照品26.540 mg，D-乳酸對(duì)照品25.060 mg，加流動(dòng)相溶解并定容到25 mL，經(jīng)稀釋并折算制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，L-乳酸的對(duì)照品濃度分別為0.212、0.425、0.637、0.849、1.062 mg/mL，D-乳酸對(duì)照品濃度分別為 0.200、0.401、0.601、0.802、1.002 mg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取乳酸菌素原料粉末約0.6 g，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，加入少量流動(dòng)相溶解，超聲處理15 min, 放冷，加溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：手性柱Chirex 3126 (D)-penicillamine（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃ ；流動(dòng)相：2 mmol/L 硫酸銅溶液（溶劑為5%異丙醇）；流速：1.000 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.4 定性與定量

將相同色譜條件下的樣品色譜圖與乳酸標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間對(duì)樣品中的L-乳酸、D-乳酸進(jìn)行定性。用外標(biāo)法定量，計(jì)算出樣品中L-乳酸和D-乳酸的含量。

2.2 短鏈脂肪酸的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

先配制高濃度混標(biāo)，逐級(jí)稀釋成9.5、8、2、1、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.005 μg/mL,然后加入內(nèi)標(biāo)。

2.2.2 供試品溶液的制備

（1）稱取樣本 20 mg 于 2 mL EP 管中，加入 1 mL磷酸（0.5% v/v）溶液渦旋10 min混勻，超聲5 min。

（2）取0.1 mL 上述樣品勻液加入到1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL MTBE（含內(nèi)標(biāo)）溶液，渦旋3 min，超聲5 min；

（3）12 000 r/min、4℃條件下離心10 min，離心后吸取上層清液0.2 mL于進(jìn)樣瓶，待GC-MS/MS分析；

2.2.3 色譜條件

色譜柱:DB-FFAP (30m×0.25mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量：3 μL；載氣：氦氣；柱流速：1.2mL/min；分流模式：2∶1；升溫程序：95 ℃保持1min，以25 ℃/min 的速度升至 100 ℃ ，以 17 ℃/min 的速度升至 130 ℃ ，保持0.4 min，以 25 ℃/min 的速度升至 200 ℃ ，保持0.5 min；掃描模式：MRM；四級(jí)桿溫度：150° C；前進(jìn)樣口溫度：200 °C；傳輸線溫度：230 °C；離子源溫度：230 °C；電離電壓：70eV。

3 結(jié)果與討論

3.1 L-乳酸與D-乳酸檢測(cè)的方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 線性與范圍

取“2.1.1”項(xiàng)下不同濃度的L-乳酸對(duì)照品溶液、D-乳酸對(duì)照品溶液，分別精密量取10 μL 注入液相色譜儀峰面積，以對(duì)照品峰面積為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)樣濃度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。

L-乳酸：y=0.0146x+0.0135(R2=0.9998)；線性范圍0.2123～1.0616 mg/mL

D-乳酸：y=0.0147x-0.0036(R2=0.9997)；線性范圍0.2005～1.0024 mg/mL

3.1.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取乳酸菌素原料的同一批樣品6 份，每份約0.6 g，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品方法平行制備，通過進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)峰面積與回歸方程計(jì)算含量。

L-乳酸的平均含量為44.2359 mg/g，RSD 值為1.48；D-乳酸的平均含量為 35.5082 mg/g，RSD 值為0.73。

圖1 L-乳酸、D-乳酸的重復(fù)性色譜圖

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取乳酸菌素原料的同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、12、16、24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)峰面積考察樣品穩(wěn)定性。L-乳酸的RSD 值為1.32%，D-乳酸的RSD 值為1.21%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 L-乳酸、D-乳酸的穩(wěn)定性色譜圖

3.1.4 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取乳酸菌素原料的同一批樣品6 份，每份稱約0.10 g，至于25 mL 容量瓶中，同時(shí)各移取10 mL同一濃度的對(duì)照品溶液（L-乳酸0.8043 mg/mL、D-乳酸0.7172 mg/mL）至容量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法平行制備，通過進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)峰面積與回歸方程計(jì)算其含量。

L-乳酸的平均回收率為98.90%，D-乳酸的平均回收率為100.26%，RSD 值分別為1.89、1.44。

3.2 不同廠家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量測(cè)定

按“2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法平行制備，對(duì)3 個(gè)不同廠家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量進(jìn)行檢測(cè)。

表1 不同廠家乳酸菌素原料中L-乳酸、D-乳酸的含量 mg/g

由表中結(jié)果可知，不同廠家的乳酸菌素原料中，L-乳酸與D-乳酸的含量有明顯差別，兩者比值均大于1。其中廠家C 的L-乳酸含量最高，廠家B 的居中,而廠家A 的含量最低,就L-乳酸含量進(jìn)行排序?yàn)镃＞B＞A。

3.3 短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定

3.3.1 短鏈脂肪酸混標(biāo)總離子流圖

7 種短鏈脂肪酸混合標(biāo)液GC-MS 總離子流色譜如圖3。

表2 7種短鏈脂肪酸的出峰時(shí)間及線性關(guān)系結(jié)果

圖3 7種短鏈脂肪酸混合標(biāo)液GC-MS總離子流色譜圖

3.3.2 短鏈脂肪酸線性關(guān)系

7種短鏈脂肪酸線性關(guān)系如表2。

3.4 不同廠家乳酸菌素原料中短鏈脂肪酸的含量測(cè)定

按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品，對(duì)3 個(gè)不同廠家乳酸菌素原料中7 種短鏈脂肪酸的含量進(jìn)行檢測(cè)。

表3 不同廠家乳酸菌素原料中短鏈脂肪酸的含量 μg/g

3.5 不同廠家乳酸菌素原料中短鏈脂肪酸主成分分析

采用SPSS 21.0 軟件，將三個(gè)廠家乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、7 種短鏈脂肪酸總量等8 個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成2 個(gè)主成分，這2 個(gè)主成分提供了100%的信息，且是綜合的，相互獨(dú)立的指標(biāo)，因此可用這2 個(gè)主成分對(duì)各樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果如表4 所示，前2 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為達(dá)100%，因此選定前2個(gè)主成分來概括樣品信息。

表4 特征值、方差貢獻(xiàn)及累積貢獻(xiàn)率

表5 是描述各因素對(duì)主成分貢獻(xiàn)的主成分系數(shù)向量，對(duì)主成分1 貢獻(xiàn)最大的是異戊酸、丙酸、戊酸、異丁酸、丁酸，對(duì)主成分2 貢獻(xiàn)最大的是7 種有機(jī)酸總量、乙酸、己酸、丁酸、異丁酸。

以 2 個(gè)主成分 F1、F2與其貢獻(xiàn)率構(gòu)建出三個(gè)廠家短鏈脂肪酸的綜合評(píng)價(jià)模型 F，F(xiàn) 是主成分 F1、F2的線性組合，即：F=72.047F1+27.953F2。

利用數(shù)學(xué)模型對(duì)三個(gè)廠家短鏈脂肪酸進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見表6。排名為C＞B＞A。

4 討 論

本研究參考高效液相色譜法[9、12]及氣質(zhì)聯(lián)用法[13-15]分別對(duì)乳酸菌素原料中的L-乳酸與D-乳酸及乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸等7 種短鏈脂肪酸進(jìn)行了含量測(cè)定，并對(duì)短鏈脂肪酸結(jié)果進(jìn)行了主成分分析。最終結(jié)合L-乳酸、7 種短鏈脂肪酸含量，判定三個(gè)廠家乳酸菌素原料質(zhì)量為C＞B＞A。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所用方法準(zhǔn)確、可靠，可作為乳酸菌素原料質(zhì)量控制的方法之一。

表5 主成分系數(shù)向量

表6 3個(gè)廠家樣品的主成分得分值排序結(jié)果

不同廠家9 種有機(jī)酸的含量不同，可能是由脫脂奶粉的發(fā)酵工藝不同造成的，如發(fā)酵菌劑的活力、發(fā)酵時(shí)間或發(fā)酵溫度的差異等。在此基礎(chǔ)上，嘗試建立乳酸菌素原料品質(zhì)更全面更科學(xué)的評(píng)價(jià)體系，加入有機(jī)酸含量和比例的控制，可為進(jìn)一步提高原料的品質(zhì)、改善發(fā)酵工藝提供科學(xué)依據(jù)。