李秀明,夏秀輝,姜承光,楊仕霞,王冰冰

（圣元營養(yǎng)食品有限公司，青島266400）

0 引 言

膽堿可以促進(jìn)大腦的發(fā)育，改善大腦的代謝，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，增強(qiáng)視力、改善鈣代謝，是嬰幼兒乳粉中重要的營養(yǎng)食品添加劑[1-3]?，F(xiàn)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中膽堿的檢測方法為酶比色法和雷氏鹽分光光度法。酶比色法操作簡單、重復(fù)性好、檢出限低、對試驗(yàn)人員相對安全，但成本較高。雷氏鹽分光光度法操作繁瑣、試劑有一定毒性，但是成本較低[3]。二者各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際操作中，兩種檢測方法均被廣泛采用。企業(yè)在檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)：采用酶比色法和雷氏鹽分光光度法對同一嬰幼兒乳粉中膽堿進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果存在一定差異。設(shè)計(jì)并完成相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果表明抗壞血酸（后文簡稱VC）對酶法測膽堿的檢測結(jié)果有顯著影響，VC 含量越高，膽堿檢測結(jié)果越低。加入活性碳粉將VC 進(jìn)行氧化可以消除影響。而雷氏鹽分光光度法不受VC 添加量的影響。膽堿和VC 都是嬰幼兒乳粉重要的食品添加劑，這一驗(yàn)證結(jié)論對企業(yè)的檢測方法選擇和方法改進(jìn)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

99.5% 酒石酸氫膽堿、過氧化物酶（美國SIGMA）、膽堿氧化酶（美國 SIGMA）、磷脂酶（美國SIGMA）、4- 氨基安替吡啉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、弗羅里硅土（100～200 目，650 ℃活化）、甲醇、三氯甲烷、氫氧化鋇、冰乙酸、乙酸甲酯、丙酮、雷納克銨鹽、活性炭。所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682中規(guī)定的三級水。

紫外可見分光光度計(jì)（UV1800），島津；電子天平（Toledo XS105DU），Mettler；熱恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA），天津泰斯特；pH 計(jì)（PHS-3C），雷磁。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品處理及測定

酶比色法和雷氏鹽分光光度法均按照GB5413.20-2013進(jìn)行操作[4]。

1.2.1 酶比色法

（1）標(biāo)準(zhǔn)系列配制：分別取 250 μg/mL 膽堿標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 2、4、6、8 mL 于 10 mL 容量瓶，用水定容至刻度，配制成 50、100、150、200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。各取 0.100 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液、0.100 mL 水于 25 mL 比色管，加入3 mL發(fā)色劑。

（2）樣品處理：稱取5 g 試樣于100 mL 錐形瓶中，加入30 mL 鹽酸溶液。將裝有試樣的容器放在70 ℃水浴中，水解3 h，冷卻。用氫氧化鈉溶液調(diào)pH 為3.5～4.0，轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，過濾。各取待分析濾液0.100 mL 于試管B、試管C兩個(gè)管中，試管B 中加入蒸餾水 3.00 mL，試管 C 中加入發(fā)色劑3.00 mL，用密封保護(hù)膜蓋住試管，混勻。

（3）測定：于37 ℃水浴中保溫反應(yīng)15 min 后取出，冷卻至室溫。在波長505 nm 處，用蒸餾水做空白，測定吸光值。以膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品凈吸光值的位置，按照GB5413.20-2013 中第一法的公式對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 雷氏鹽分光光度法

（1）標(biāo)準(zhǔn)系列配制：分別吸取膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 注入層析柱中。

（2）樣品處理：稱取固體試樣10 g(精確到0.01 g)，加入50 mL 氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷提取液?；旌暇鶆蚝蠼尤牖亓餮b置，于80 ℃的水浴鍋內(nèi)水解抽提4 h。每隔1 h 震蕩一次，以避免試樣結(jié)塊。水解抽提結(jié)束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸甲醇混合液洗滌3 次～4 次，洗液一并收集于100 mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混勻。吸取10 mL 試樣水解液（12.1）于層析柱中。當(dāng)溶液完全進(jìn)入柱床后，依次用 5 mL 和10 mL 甲醇，20 mL 乙酸甲酯洗滌層析柱。再加入5 mL 雷納克銨鹽溶液，用適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現(xiàn)硅土原有的白色。

（3）測定：用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于10 mL 的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脫液混濁需過0.45 μm 的濾膜）。在波長526 nm 處測定溶液的吸光值。以膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品吸光值的位置，按照GB5413.20-2013中第二法的公式對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 不同檢測方法對結(jié)果的影響

分別用酶比色法和雷氏鹽分光光度法對某一未添加VC 的樣品（命名為樣品1）和某一添加VC 的樣品（命名為樣品2）分別進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，驗(yàn)證兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著差異。

1.3.2 VC 對酶法檢測結(jié)果的影響

在樣品1（經(jīng)檢測VC 本底值為7.8 mg/100g）中加入不同含量的VC，按照酶比色法的操作步驟進(jìn)行處理和檢測，同時(shí)對處理后的VC 含量進(jìn)行檢測。驗(yàn)證VC 對酶法檢測結(jié)果的影響。

1.3.3 酶法測膽堿的方法改進(jìn)

設(shè)計(jì)如下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，從兩個(gè)方面對酶法檢測方法進(jìn)行改進(jìn)。

實(shí)驗(yàn)1：在樣品1 中加入不同含量的VC，按照酶比色法的操作步驟進(jìn)行處理和檢測，同時(shí)取另一組將膽堿氧化酶和過氧化物酶進(jìn)行加倍處理。增加酶法中的膽堿氧化酶和過氧化物酶使用量，驗(yàn)證酶量的增加是否可以消除VC 對酶的抑制作用。

實(shí)驗(yàn)2：在樣品1 中加入不同含量的VC，在前處理時(shí)加入2 g 活性碳粉（酶比色法中規(guī)定的樣品稱樣量為5 g，活性碳粉使用量參照GB5009. 86 -2016）[5]將VC 氧化，按照酶比色法的操作步驟進(jìn)行處理和檢測，同時(shí)對處理后的VC 含量進(jìn)行檢測。驗(yàn)證樣品中VC 經(jīng)氧化后是否可以消除對酶法檢測結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢測方法對結(jié)果的影響

表1 結(jié)果顯示，樣品1 采用兩種方法分別進(jìn)行檢測的檢測結(jié)果無顯著差異，但樣品2 的檢測結(jié)果存在顯著差異。這表明樣品是否添加VC 對雷氏鹽法的測定結(jié)果無影響，而對酶比色法的測定結(jié)果有顯著影響，分析原因可能是VC 本身的強(qiáng)還原性對酶法中的膽堿氧化酶和過氧化物酶產(chǎn)生了抑制作用，影響了酶作用的發(fā)揮。

2.2 VC 對酶法檢測結(jié)果的影響

表2 及圖1 結(jié)果表明：樣品經(jīng)70 ℃消化處理后VC 會(huì)有一定量的損失，但是膽堿檢測結(jié)果與消化前后樣品中VC 含量都呈明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.9981 和0.9995，說明VC 對酶比色法的檢測結(jié)果存在直接影響。一定范圍內(nèi)，VC 含量越高，膽堿檢測結(jié)果越低，而且消化過程中VC 的損耗不會(huì)消除這種抑制作用。

2.3 酶法測膽堿的方法改進(jìn)

表3 結(jié)果顯示，正常酶量與雙倍酶量的檢測結(jié)果符合檢測平行樣之間的誤差要求，表明增加酶的使用量不會(huì)消除VC 對酶的抑制作用。

表4 結(jié)果顯示，加入碳粉的樣品經(jīng)70 ℃消化處理后VC 損耗率很高，殘余VC 含量很低，說明加入碳粉再消化，樣液中含量300 mg/100g 以內(nèi)的VC 基本可以被氧化完全。將本次膽堿檢測結(jié)果與未強(qiáng)化VC 時(shí)的雷氏鹽檢測結(jié)果（參見表1 中樣品1 檢測結(jié)果）進(jìn)行雙樣本等方差t 檢驗(yàn)：t-stat 值為0.7933，t-雙尾臨界值為2.2622，t-stat

表1 酶法和雷氏鹽法的檢測結(jié)果

表2 樣品1添加不同含量VC后的酶法檢測結(jié)果

圖1 樣品消化前后VC含量與膽堿檢測結(jié)果相關(guān)性

表3 樣品1添加不同酶量膽堿檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

（1）VC 對酶法測膽堿的檢測結(jié)果有直接影響，在添加量300 mg/100g 范圍內(nèi)，VC 含量越高，膽堿檢測結(jié)果越低，但雷氏鹽法檢測結(jié)果不受VC 含量影響。分析原因可能是VC 的強(qiáng)還原性對酶法中的膽堿氧化酶和過氧化物酶產(chǎn)生了抑制作用，影響了酶作用的發(fā)揮。

（2）樣品前處理時(shí)，在5 g 樣品中加入2 g 活性炭粉可以通過將VC 氧化消除對酶法檢測結(jié)果的影響。

酶比色法是國家標(biāo)準(zhǔn)中的第一法，一般被視為仲裁法，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性非常重要?；钚蕴糠墼跇悠废凹尤?，后期樣品過濾過程中可以被完全去除，添加后除了氧化VC，不會(huì)對酶法的檢測原理和檢測步驟產(chǎn)生較大影響，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)具有較強(qiáng)的可操作性。