摘 要：建立Taqman探針實時熒光PCR檢測方法。選擇牛、羊線粒體16SrRNA靶序列，設計合成引物和探針，鑒別羊乳制品中的羊乳成分。結果表明，該方法最低可檢測摻入2.0%牛源性成分的羊奶制品，具有靈敏、快速、高效以及高通量等優(yōu)勢，可作為羊奶制品羊乳成分摻假鑒別手段之一。

關鍵詞：羊乳制品摻假；牛乳；實時熒光PCR；Taqman探針法

羊乳制品的營養(yǎng)價值高，現(xiàn)代營養(yǎng)學的相關研究表明，羊乳含有200多種營養(yǎng)物質和生物活性因子，其蛋白質、礦物質和維生素的總含量均高于牛乳[1]。羊乳中蛋白質凝塊細而軟，脂肪顆粒較小，易消化吸收[2]，人體對羊乳的吸收率在94%以上，特別適合嬰幼兒、老年人和身體虛弱者飲用。營養(yǎng)成分組成及基礎結構、各營養(yǎng)元素配比以及營養(yǎng)特性都與母乳最為接近，因此在嬰幼兒食品中優(yōu)勢明顯。同時羊乳中不含過敏性蛋白，不易出現(xiàn)過敏等現(xiàn)象，被營養(yǎng)學家推薦為牛乳過敏人群的最佳替代乳品[3-4]。近年來，羊乳相關產(chǎn)品的流行已漸成趨勢，市場上產(chǎn)品種類越來越多，在經(jīng)濟利益的驅動下，一些不法商販和企業(yè)在羊乳中摻入牛乳以降低成本，牟取暴利。實時熒光PCR技術從基因水平分析物種來源，Taqman real-time PCR法具有靈敏度更高、特異性更強的特點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

鮮羊乳來自內蒙古蒙恩公司純羊奶，牛乳來自市售伊利集團有限公司。

1.1.2 主要儀器和材料

儀器：實時熒光PCR儀（Quant StudioTM 7 Flex）購于賽默飛世爾公司，超微量紫外分光光度計（Nano drop one）購于賽默飛世爾公司。

試劑：PCR引物和探針（上海生工生物工程有限公司合成）；Wizard磁珠法食品DNA純化系統(tǒng)（貨號：FF 3751）由美國Promega生物技術公司生產(chǎn)；Probe qPCR mix（貨號：RR391A）TakaRa（中國）寶日生物公司；Real-time PCR Bovine DNA Detection Kit（貨號：RR910）TakaRa（中國）寶日生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂樣品的制備

新鮮奶粉中脂肪含量較高，需要先去除脂肪純化樣品[6]。樣品冷藏1～2 h，2 000 g離心5 min，去除上層脂肪。若為脫脂樣品則直接用于DNA提取。

1.2.2 DNA的提取

乳制品中DNA含量低，因此稱取脫脂后樣品1 g放入50 mL離心管中，之后按照提取試劑盒說明書中的步驟進行操作，最后用50 μL無核酸酶水洗脫，洗脫步驟可分多次洗脫，以提高回收率。提取后的樣品經(jīng)超微量紫外分光光度計測定，DNA濃度為752 ng/mL和810 ng/mL，于4 ℃保存。

1.2.3 引物設計

采用Prmimer Premier 5.0引物設計軟件，經(jīng)Blast比對后選取特異性引物和探針。牛源性引物及探針均采用TakaRa公司試劑盒。引物探針序列見表1。

1.2.4 Taqman實時熒光定量PCR反應

25μL PCR反應體系：12.5 μL qPCR mix（2×），0.5 μL上下游引物，1μL探針，2 μL模板，8.5 mL ddH20。

PCR上機程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 乳DNA中羊源性成分、牛源性成分特異性檢測

選取線粒體基因組參照文獻[5]設計羊源性特異性引物因為脊椎動物線粒體基因在物種間特異性強。

實驗結果表明，在羊源性引物中加入羊源性引物探針，牛源性引物中加入牛源性引物探針觀察到明顯擴增曲線，如圖1。

在交叉模板中未出現(xiàn)擴增曲線，結果見圖2。證明所設計的引物和探針具有較為明顯的特異性。通過實驗證明，根據(jù)牛、羊引物探針的特異性所建立的基于Taqman探針法實時熒光定量PCR可以用于羊奶中羊源性成分特異性檢測。

此外，乳制品在加工中DNA有所降解，為了解不同提取方法對羊乳DNA的適用性，在提取DNA時選用普通動物源性DNA提取試劑盒，Wizard磁珠法食品DNA富集提取等方法進行比較，結果證明當模板DNA含量低時，利用磁珠富集法提取更適合于乳制品的檢測。

2.2 Taqman實時熒光定量PCR對羊乳中DNA檢測靈敏度

驗證Real-time PCR法能夠檢測出牛、羊乳中DNA質量濃度的最低值，考慮到乳制品中復雜體系及乳細胞分布不均的情況，并且市售產(chǎn)品多為直接將牛乳摻入羊乳中，因此采用將不同比例牛乳摻入羊乳中為樣品，稀釋成濃度梯度為含牛乳比例100%、50%、10%、5%、2%與1%，結果證明，當摻入2%牛乳時ct值為32.25，當濃度為1%時，無擴增曲線，因此最低摻假檢測靈敏度為2%。如圖3。

3 結語

本文依據(jù)羊線粒體基因的差異設計了特異性引物和探針，建立了快速鑒別羊乳摻假的Taqman實時熒光定量PCR檢測方法，最低摻偽檢出限為2.0%，并選用磁珠法提取，能夠較好的滿足市售摻偽產(chǎn)品鑒別的需求。此法特異性高、靈敏度強，能夠準確檢測羊乳制品中羊源性、牛源性成分，為市售商品的監(jiān)管提供快速準確的技術手段。

參考文獻

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[2]Mininni a， Pellizzari c， Cardazzo b， et al.Evaluation of real-time PCR assays for detection and quantification of fraudulent addition of bovine milk to caprine and ovine milk for cheese manufacture[J]International Dairy Journal，2009，19（10）：617-623.

[3]Park YW，M.Juarez b， M Ramos，et al.Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk[].Small Ruminant Research，2007，68（1）：88-113.

[4]Park YW.Hypo-allergenic and therapeutic significance of goat milk [J]. Small Rumin Res，1994，14（14）：151-159.

[5]Koppel R，Jurg R. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef，pork，horse and sheep[J]. European Food Research and Technology，2011，232（6）：151-155.

[6]黎穎，巫賢，林波，等.羊乳及其制品中摻入牛屬牛乳和水牛乳的檢測[J].基因組學與應用生物學，2015（5）：977-981.

作者簡介：張艷茹（1988—），女，滿族，內蒙古包頭人，本科，助理工程師。研究方向：分子生物技術檢測。