李志江，趙婧，戴凌燕，周雯君，徐瑋東，鹿保鑫*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)生工作處，哈爾濱 150088)

傳統(tǒng)的豆醬生產(chǎn)工藝復(fù)雜，醬醅經(jīng)成曲中復(fù)合酶系和天然微生物的作用，其中大豆中的大分子物質(zhì)被酶降解，同時，天然微生物參與代謝合成風(fēng)味物質(zhì)，使得豆醬的營養(yǎng)豐富、香氣醇厚[1,2]。但傳統(tǒng)制醬耗時長，微生物菌系復(fù)雜，易受雜菌污染，不利于工廠化生產(chǎn)[3]。采用人工接種米曲霉進行制曲，在發(fā)酵階段采用控制發(fā)酵溫度和自然發(fā)酵，是一些大型豆醬企業(yè)采用的主要生產(chǎn)方式，而在發(fā)酵過程中接種有益微生物的應(yīng)用實踐與研究則較少報道。但豆醬的品質(zhì)與發(fā)酵過程控制和微生物調(diào)控聯(lián)系密切，如參與發(fā)酵的微生物種類和數(shù)量不足，導(dǎo)致產(chǎn)品揮發(fā)性香氣較差；或者由于受季節(jié)影響，各個批次的豆醬口感和香氣也可能略有差異[4,5]。因此，探討人工接種方式進行豆醬的品質(zhì)和增香效果研究，具有較好的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)是一種常見的嗜高滲透壓酵母菌，能夠在高鹽環(huán)境中生長。Z.rouxii利用淀粉質(zhì)原料降解產(chǎn)生糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，代謝生成乙醇，并伴隨產(chǎn)生高級醇和芳香雜醇類副產(chǎn)物，還能產(chǎn)生類似焦糖味的呋喃酮類化合物，是傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的重要增香微生物[6-9]，酵母菌體的自溶也是很好的增香提鮮物質(zhì)[10]。李琴等[11]在低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的工藝中，探討了Z.rouxii和球擬酵母對醬油品質(zhì)提升具有明顯的效果。江潔等[12]在利用多菌發(fā)酵生產(chǎn)黃稀醬時，證實人工接種可縮短傳統(tǒng)豆醬的生產(chǎn)周期，產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味得到顯著改善。資料表明，豆醬工業(yè)化生產(chǎn)中添加增香酵母進行增香應(yīng)用研究較少，尤其是對豆醬品質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化影響研究鮮有報道。本研究以黑龍江某大型醬廠發(fā)酵車間為醬醅采集基地，結(jié)合企業(yè)生產(chǎn)情況進行試驗，以豆醬總酸、總酯、氨基酸態(tài)氮含量以及感官評定為指標，以揮發(fā)性香氣成分檢測結(jié)果為依據(jù)，確定不同接種量魯氏酵母對揮發(fā)性香氣成分的影響，解決豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)不足和質(zhì)量低等技術(shù)難題，為豆醬產(chǎn)品質(zhì)量提升提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬醅：來源于黑龍江省某大型醬廠發(fā)酵車間，成曲質(zhì)量和發(fā)酵工藝控制均按企業(yè)標準進行。

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(編號1378)；YPD培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉(NaOH)和鄰苯二甲酸氫鉀(C8H5KO4)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酚酞和甲醛：煙臺三和化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PE20酸度計 Mettler Toledo公司；79-1磁力攪拌器 江蘇省金壇市虹盛儀器廠；THZ-82恒溫水浴振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Trace 1300氣相色譜儀和質(zhì)譜儀 Thermo Scientific公司；TDZ5-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗與檢測方法

1.3.1 樣品制備

取醬廠發(fā)酵第7天的醬醅(發(fā)酵溫度43～45 ℃)，接種(0.5～2.0)×106個/g魯氏酵母，分別繼續(xù)發(fā)酵至14天(發(fā)酵溫度42～44 ℃)、21天(發(fā)酵溫度37～39 ℃)和28天(發(fā)酵溫度37～39 ℃)，翻醬次數(shù)和溫度控制按企業(yè)標準執(zhí)行，測定醬醅的總酸、總酯和氨基酸態(tài)氮含量等常規(guī)指標。

1.3.2 常規(guī)指標的檢測方法

滴定法測定醬醅中總酸含量(按GB/T 5009.39-2003進行測定，單位g/100 g)，甲醛電位法測定醬醅中氨基酸態(tài)氮含量(按GB/T 5009.39-2003進行測定，單位g/100 g)，回流滴定法測定醬醅中總酯含量(按GB/T 10345.5-1989進行測定，以乙酸乙酯計，單位g/100 g)。

1.3.3 感官評價方法

采用線性標度法，對發(fā)酵至第28天的豆醬進行色澤、體態(tài)和香氣感官評定[13]。

1.3.4 揮發(fā)性香氣成分測定方法

采用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的方法[14]對人工接種Z.rouxii和未接種的醬醅進行揮發(fā)性香氣物質(zhì)分析。

取各處理的醬醅7 mL，置于15 mL樣品瓶中，每個樣品中分別加入2.0 g的氯化鈉(NaCl)，經(jīng)過混合后密封待測。在樣品瓶中插入100 μm PDMS萃取纖維頭，將纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中，40 ℃恒溫萃取50 min(轉(zhuǎn)速250 r/min)后，將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進樣口進行解吸。

氣相色譜條件：DB-5毛細管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱箱溫度為50 ℃；進樣溫度為240 ℃，載氣為He，流速為1 mL/min；采用程序升溫的方式，起始溫度為50 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min的速度使溫度增加至240 ℃，保持5 min的恒定時間，不分流進樣。質(zhì)譜設(shè)定的條件：能量要求：EI電離源，能量為70 eV，倍增電壓1400 V；溫度要求：離子源的溫度為200 ℃，接口溫度設(shè)定為250 ℃，四級桿溫度設(shè)定為150 ℃，掃描范圍為40～450 m/z，時間間隔為0.3 s。

1.4 軟件使用與數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用平均值±標準偏差方式表示，利用Excel 2007軟件進行作圖。利用計算機譜庫進行揮發(fā)性成分的定性分析，并用峰面積歸一化法定量，測定2次取平均值。非參數(shù)檢驗利用SPSS 19.0軟件計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯氏酵母對豆醬品質(zhì)的影響

該企業(yè)豆醬發(fā)酵周期為28天，并調(diào)控溫度，以達到產(chǎn)品的企業(yè)和國家標準。前期7天發(fā)酵溫度為43～45 ℃，主要目的是利用成曲中的蛋白酶和淀粉酶等水解大豆中的大分子物質(zhì)，為微生物生長代謝提供小分子物質(zhì)[15]。按照企業(yè)的生產(chǎn)要求，為保障豆醬產(chǎn)品質(zhì)量和調(diào)控發(fā)酵工藝參數(shù)，對發(fā)酵過程和醬醅品質(zhì)進行了監(jiān)控。

圖1 不同接種量的魯氏酵母對醬醅品質(zhì)及感官評價影響結(jié)果Fig.1 Effects of Zygosaccharomyces rouxii on the content of total acidity, total ester and amino acid nitrogen and sensory evaluation during the fermentation of soybean paste

注：圖1中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分別為醬醅發(fā)酵至第14，21，28天的總酸、總酯和氨基酸態(tài)氮含量測定結(jié)果，圖1中Ⅳ為感官評價結(jié)果；a與A分別表示各處理組相應(yīng)指標與對照組相比較顯著性差異P<0.05和P<0.01，未標注為無顯著性差異；b與B分別表示處理組內(nèi)，與相應(yīng)最高值指標相比較顯著性差異P<0.05和P<0.01，未標注為無顯著性差異。

圖1中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分別為不同接種量時發(fā)酵至第14，21，28天時，醬醅中總酸、總酯和氨基酸態(tài)氮的含量測定結(jié)果。由圖1中 Ⅰ 可知，與未接種魯氏酵母對照組比較，接種魯氏酵母的處理組醬醅(發(fā)酵溫度42～44 ℃)中，總酯含量逐漸增加，且最大值提高了2.06 g/100 g，而總酸和氨基酸態(tài)氮含量則變化不明顯。說明魯氏酵母的接入改變了醬醅的天然發(fā)酵進程，代謝產(chǎn)生的醇類化合物發(fā)揮了主要作用，并與乳酸菌等代謝產(chǎn)生的酸類物質(zhì)化合形成酯類，導(dǎo)致醬醅的酯類香氣物質(zhì)含量顯著增加。處理組內(nèi)，1.5×106個/g接種量時的醬醅中，總酸含量最高，推測是魯氏酵母與醬醅中天然存在的微生物之間具有拮抗作用，產(chǎn)酸菌及酸類化合物占優(yōu)勢，應(yīng)進一步分析微生物之間的數(shù)量和消長因素。隨著醬醅發(fā)酵至第21天(中期發(fā)酵)和溫度降至37～39 ℃(見圖1中Ⅱ)，當接種量為2.0×106個/g時，處理組中的總酯含量與對照相比含量僅增加了1.00 g/100 g，而總酸和氨基酸態(tài)氮含量則分別增加了0.17，0.12 g/100 g。處理組內(nèi)，總酯含量增加，但含量差異較7～14天小，最大差異僅為0.65 g/100 g；總酸含量隨著接種量增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，最高值為2.85 g/100 g，氨基酸態(tài)氮含量差異較小。此階段是在較低溫度下完成的，且微生物代謝處于旺盛階段，是醬醅發(fā)酵的關(guān)鍵過程和決定代謝產(chǎn)物含量的主要時期，微生物的拮抗和代謝產(chǎn)物的累積也十分明顯[16]?？偹岷吭黾颖砻鳟a(chǎn)酸微生物雖然繼續(xù)發(fā)揮主要作用，可能由于營養(yǎng)底物的消耗、溫度的降低和菌體的老化，造成魯氏酵母等代謝生成醇類物質(zhì)減少，其與酸類的化合作用生成酯類物質(zhì)的能力減弱。在醬醅后發(fā)酵和成熟時期的7天(見圖1中Ⅲ)，與對照組相比較，總酯含量繼續(xù)緩慢升高至最大差異量為0.86 g/100 g，氨基酸態(tài)氮含量繼續(xù)增加至最大為0.24 g/100 g。接種量為1.5×106個/g時，總酸含量最大差異為0.87 g/100 g；處理組內(nèi)則各指標差異較小，說明不同接種量的魯氏酵母之間發(fā)酵能力差異逐漸減弱。

以上結(jié)果表明，控溫發(fā)酵和魯氏酵母的接入，調(diào)控醬醅總酸、總酯和氨基酸態(tài)氮含量，3個指標在監(jiān)測時間點內(nèi)各值增加逐漸變緩，至發(fā)酵結(jié)束時，均較對照組含量高，說明魯氏酵母可以較好地提高豆醬的品質(zhì)。

2.2 豆醬感官評價結(jié)果

利用線性標度法，對發(fā)酵28天的成熟豆醬進行感官評定，見圖1中Ⅳ。隨著Z.rouxii接種量增大，豆醬色澤、體態(tài)、香氣等感官評分逐漸呈現(xiàn)上升的趨勢，且均高于對照組。當接種量為2.0×106個/g時，豆醬的色澤、體態(tài)、香氣等感官得分均高于其他處理組，豆醬的外觀顏色呈現(xiàn)較好的紅褐色且具有光澤，粘稠度適中，醬香濃郁。主要由于較高接種量代謝累積總酯及其他揮發(fā)性香氣物質(zhì)所致，同時，豆醬的感官質(zhì)量符合企業(yè)產(chǎn)品標準。

2.3 豆醬揮發(fā)性香氣成分測定與分析

利用上述實驗結(jié)果，分別對未添加和添加2.0×106個/gZ.rouxii的豆醬進行了揮發(fā)性香氣成分分析，結(jié)果見表1。

表1 揮發(fā)性香氣成分含量分析表Table 1 Aroma components content in soybean paste

續(xù) 表

注：“-”表示測試結(jié)果未檢出；琥布宗為4-丁基-4-(羥甲基)-1,2-二苯基-3,5-吡唑烷二酮丁二酸單酯。

未添加Z.rouxii的豆醬檢測出揮發(fā)性香氣成分共22種，其中醇類4種、酯類5種、酸酚類6種、醛酮類3種以及其他類4種，分別占總揮發(fā)性香氣成分的5.04%，11.11%，12.12%，3.56%，3.78%；添加2.0×106個/gZ.rouxii的豆醬中，檢測出揮發(fā)性香氣成分34種，其中醇類6種、酯類10種、酸酚類7種、醛酮類5種以及其他類6種，分別占總揮發(fā)性香氣成分的9.56%，64.82%，9.62%，2.31%，5.01%。

2種豆醬中揮發(fā)性香氣成分差異較大，其中添加Z.rouxii的豆醬中揮發(fā)性香氣成分增加了12種，但也有9種揮發(fā)性香氣成分與對照組相同。各組分峰面積比變化較大，醇類和酯類成分的組分和含量明顯增加，與上述魯氏酵母增加醬醅中的總酯含量測定結(jié)果一致。同時，Z.rouxii的添加可以改善豆醬的揮發(fā)性香氣成分，使得豆醬香氣濃郁，與上述豆醬的感官評價結(jié)果吻合。

2.3.1 醇類物質(zhì)的比較分析

酵母菌是代謝貢獻醇類化合物的主要微生物，醇類化合物閾值高，對風(fēng)味的貢獻主要是與酸類化合進一步形成酯類化合物，主要作為酯類物質(zhì)合成的前體物質(zhì)[17]。與對照豆醬樣品相比，處理組中醇類總峰面積增加了4.52%，但2組樣品中均檢測出具有玫瑰香氣感受的苯乙醇，其峰面積比由1.32%上升至3.61%，進一步解釋了豆醬香氣增加的原因。魯氏酵母的主要作用是醇類發(fā)酵，并進一步合成多種酯類香氣成分、甘油和多元醇以及其他酮、酚等物質(zhì)，在豆醬的品質(zhì)和感官評價中具有重要的作用[18]。

2.3.2 酯類物質(zhì)的比較分析

酯類物質(zhì)是豆醬香氣的重要組成部分，樣品中酯類峰面積比由對照組的11.11%增加至64.82%，且種類變化較大，其中處理組酯類物質(zhì)種類增加了8種。棕櫚酸乙酯和亞油酸乙酯在2組樣品中均被檢出，魯氏酵母的添加導(dǎo)致其含量也顯著增加。酯類物質(zhì)是豆醬香氣的重要化合物，為豆醬提供甜香和果香等感官特征，主要來自于酵母酶催化合成，其次是由有機酸和醇的酯化反應(yīng)合成[19]。Z.rouxii不僅代謝產(chǎn)生乙醇主產(chǎn)物，還可以生產(chǎn)高級醇及芳香雜醇類次生代謝產(chǎn)物，同時，在高鹽環(huán)境中還能轉(zhuǎn)化糖類物質(zhì)生成多元醇及糖醇類風(fēng)味物質(zhì)，并進一步與酸類物質(zhì)化合成酯類物質(zhì)[20]。此外，具有水果香的苯甲酸乙酯也在處理組中檢測到，為豆醬酯香提供了化學(xué)依據(jù)，與已有的報道結(jié)果相似[21]。

2.3.3 酸酚類物質(zhì)的比較分析

添加魯氏酵母的豆醬中，酸物質(zhì)的種類和峰面積比顯著下降7.33%，是由于魯氏酵母代謝產(chǎn)生多種醇類物質(zhì)并消耗酸而發(fā)生酯化反應(yīng)所致。而添加魯氏酵母后，酚類含量及種類明顯提高；同時，具有木香味的4-乙基愈創(chuàng)木酚和具有煙熏香味的對乙烯基愈創(chuàng)木酚這2種酚類化合物還具有辛香、藥香、木香及類似丁香的香氣，且含量顯著提升，對豆醬香氣的形成貢獻很大[22,23]。在趙建新等及徐琳娜等[24]對傳統(tǒng)豆醬揮發(fā)性成分分析中，這2種物質(zhì)也被檢測到且含量較高。

2.3.4 醛酮類物質(zhì)的比較分析

醛酮類成分均是不穩(wěn)定的中間體化合物，其含量超過閾值易使豆醬形成令人不舒服的氣味，在2組豆醬中均含具有類似風(fēng)信子和水果的甜香氣的苯乙醛和苯甲醛，含量相差不大，這2種醛都是由高級醇和不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)生的。只在接種魯氏酵母的樣品中檢測出酮類物質(zhì)，可能是魯氏酵母代謝產(chǎn)物，其含量與魯氏酵母代謝有關(guān)。同時，脂肪分解可產(chǎn)生一定量的醛類和酮類化合物。

2.3.5 其他類物質(zhì)的比較分析

主要是烷烴類、醚類和酰胺類物質(zhì)，2種豆醬中的峰面積相差不大，但處理組中種類更加豐富。烴及其衍生物是一些小分子代謝產(chǎn)物，對豆醬的香氣貢獻較小[25]，但可以作為酵母菌的營養(yǎng)源，進一步合成酯類物質(zhì)，在處理組豆醬中可能由魯氏酵母代謝合成。而醚類可能是在較高溫度下，由醇類脫水化合而成。

2.4 因子分析

為檢驗添加和未添加魯氏酵母的豆醬揮發(fā)性香氣總體的均值是否有顯著的差別，采用2個獨立樣本非參數(shù)檢驗——Mann-Whitney U檢驗進行因子分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 秩和檢驗結(jié)果Table 2 Values of rank sum

表3 檢驗統(tǒng)計量aTable 3 Test Statisticsa

注：a為分組變量：組別。

通過SPSS 19.0軟件對揮發(fā)性香氣成分數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(已知P=0.05)，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結(jié)果可知，2組獨立數(shù)據(jù)P=0.000<0.001，即與處理組相比較，Z.rouxii對豆醬中揮發(fā)性香氣成分的提升效果非常顯著，說明Z.rouxii對豆醬香氣感官的影響非常顯著，提升了豆醬產(chǎn)品質(zhì)量。

3 結(jié)論

該研究是在企業(yè)標準條件下，探討人工接種魯氏酵母對豆醬總酸、總酯、氨基酸態(tài)氮含量的影響與監(jiān)控，結(jié)果表明：魯氏酵母可顯著提高不同發(fā)酵階段醬醅各指標含量。酸類物質(zhì)在前期發(fā)酵過程中變化最大，為醬醅中、后期揮發(fā)性香氣物質(zhì)提供了基礎(chǔ)。隨著發(fā)酵進入中期和后期以及醬醅溫度的降低，總酯含量增加，賦予豆醬醇厚的香氣。感官評定指標結(jié)果進一步表明：魯氏酵母的添加可顯著提高豆醬的感官和理化品質(zhì)，為魯氏酵母的工廠化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。揮發(fā)性香氣成分分析結(jié)果表明：Z.rouxii對豆醬香氣產(chǎn)物的生成具有顯著影響，添加Z.rouxii可以明顯改善豆醬揮發(fā)性香氣成分，提高了豆醬產(chǎn)品質(zhì)量，為Z.rouxii在豆醬生產(chǎn)中的工業(yè)化應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。