張曉敏，李光來

腦血管病是現(xiàn)實(shí)生活中危害人類生命健康的常見病和多發(fā)病，以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。在腦血管病的治療中，肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理（LEP）在腦保護(hù)方面的研究是近年研究的熱點(diǎn)之一，但對于其具體機(jī)制仍不十分明確和完善，因此進(jìn)一步探討肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理在腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用尤為重要。本課題通過觀察肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理時(shí)對大鼠腦缺血及缺血再灌注腦組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）及三磷酸腺苷（ATP）酶水平的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為腦缺血患者的臨床治療提供一條安全、無創(chuàng)、有效的新途徑，達(dá)到及時(shí)指導(dǎo)、早期治療、提高患者生存率和生存質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 在山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心選取成年健康雄性Wistar大鼠42只，鼠齡3個(gè)月～4個(gè)月，體重200g～250g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 42只 Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A

組）、腦缺血組（B組）、腦缺血再灌注組（C組）、LIP組（D組）。LIP組再分為4組：LIP 0h組（D1組）、LIP 6h組（D2組）、LIP 12h組（D3組）、LIP 24h組（D4組），分別在LIP后即刻、6h、12h、24h行腦缺血再灌注。每組各6例。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 721分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL－16G高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械廠）；XW－80A漩渦混合器（上海手術(shù)器械廠）；醫(yī)用低溫冰箱（日本三洋公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；JY98－ⅢN超聲波破碎儀（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.1.4 主要試劑 微量MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒、超微量ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白含量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。普通試劑由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。721分光光度計(jì)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型的制備 采用改良Longa法［1］建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型。將大鼠用10%水合氯醛3mL／kg腹腔麻醉，頸正中右旁開0.5 cm～1cm切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈、頸總動脈近心端，在頸總動脈距離分岔口大約5 cm處用眼科剪剪開一小口，將直徑0.236mm的進(jìn)口魚線插入，以分岔口處開始測量距離，插入1.8cm～2cm后固定魚線，縫合。缺血2h后將線栓拉出1cm左右即可，形成再灌注。其中假手術(shù)組插入1.0cm魚線。神經(jīng)功能缺損評分按照Longa等［1］的5級4分法標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理方法 大鼠仰臥固定，根據(jù)氣壓式肢體循環(huán)促進(jìn)儀構(gòu)造［2］自制小型充氣氣囊設(shè)備，在雙側(cè)股動脈處充氣10min夾閉股動脈造成肢體缺血，松氣再灌注10 min，反復(fù)4次。

1.2.3 神經(jīng)功能缺陷評分標(biāo)準(zhǔn) 采用Longa等的5級4分法。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾不能伸展左側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)過程中的動物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)過程中，適當(dāng)用白熾燈照射動物，維持其肛溫在37℃左右，直到恢復(fù)活動，室溫保持20℃以上，除去未出現(xiàn)相應(yīng)腦缺血體征或缺血后出現(xiàn)癲癇及生命體征不平穩(wěn)的大鼠。

1.2.5 腦組織病理切片的制備及MDA、SOD、ATP含量的測定 各組大鼠缺血2h再灌注24h后行神經(jīng)功能評分后頸椎脫臼處死，在冰盤上快速取腦，置0℃～4℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，各組隨機(jī)取1只大鼠右側(cè)腦組織迅速固定，石蠟包埋后，在海馬部位做矢狀切片，厚約5μm，HE染色，觀察腦組織變化。剩余右側(cè)腦組織加入9倍量的0℃～4℃生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成10%的腦勻漿，3 000r／min離心15min，取上清液檢測MDA、SOD、ATP。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟要求操作，計(jì)算出各項(xiàng)指標(biāo)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間定量資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下腦組織HE染色結(jié)果 A組大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常。B組、C組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死明顯，胞體腫脹，周圍間隙增寬，結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解。D組神經(jīng)細(xì)胞呈輕度缺血改變，變性壞死不明顯，胞體呈輕度腫脹，神經(jīng)細(xì)胞缺失較B組、C組輕。

2.2 各組腦組織SOD活力、MDA含量比較 各組中SOD活力的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組、C組、D組的SOD值均低于A組。D1組、D2組與B組和C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且SOD值均高于B組，推測預(yù)處理初期有效。D3組、D4組與D1組、D2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組中MDA含量的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組、C組、D組的MDA值均高于A組。D1組、D2組、D3組、D4組與B組及C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且MDA值均低于B組、C組，說明預(yù)處理后 MDA含量有所下降。D3組、D4組與D1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組中SOD活力與MDA含量的比較（±s）

表1 各組中SOD活力與MDA含量的比較（±s）

MDA含量nmol／mgp組別 n SOD活力U／mgprot rot 6 135.08±4.21 1.55±0.38 B組 6 96.65±4.121） 3.98±0.211）C組 6 98.19±4.761） 3.13±0.611）2）D1組 6 121.94±8.331）2）3） 1.95±0.472）3）D2組 6 116.67±10.341）2）3） 2.34±0.471）2）3）D3組6 103.83±5.661）4）5） 2.62±0.381）2）3）4）D4組6 101.66±3.201）4）5） 2.53±0.451）2）3）4）與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05；與D1組比較，4）P＜0.05；與D2組比較，5）P＜0.05 A組

2.3 各組腦組織 ATP含量比較 各組中 Na＋－K＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋－ATP含量的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且B組、C組、D3組、D4組 Na＋－K＋－ATP含量均低于 A組（P＜0.05）。D1組、D2組、D3組、D4組 Na＋－K＋－ATP含量均高于 B組與 C組（P＜0.05）；D1組、D2組 Ca2＋－Mg2＋－ATP含 量 均 高 于 B 組 （P＜0.05）。D3 組、D4組 Na＋－K＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋－ATP含 量 低 于D 1組 、D 2組 （P＜0.05）。各組中總ATP含量的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且ATP含量均低于A組。D1組、D2組總ATP含量高于B組（P＜0.05）。D1組總ATP含量高于C組（P＜0.05）。D3組、D4組總ATP含量均低于D1組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組中ATP含量比較（±s）

表2 各組中ATP含量比較（±s）

組別 n Na＋－K＋－ATP Ca2＋－Mg2＋－ATP 總6 8.09±0.99 5.56±0.67 21.15±2.27 B組 6 2.89±0.651） 1.94±0.571） 15.54±2.071）C組 6 4.08±0.731）2） 2.37±0.561） 16.57±2.641）D1組 6 7.77±1.002）3） 4.80±0.741）2）3） 20.67±2.162）3）D2組 6 7.37±0.782）3） 4.79±0.541）2）3） 18.26±2.521）2）D3組 6 6.39±0.851）2）3）4）5）2.76±0.421）2）4）5） 17.74±1.711）4）D4組 6 5.37±0.691）2）3）4）5）2.32±0.461）4）5） 17.33±1.311）4）與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05；與D1組比較，4）P＜0.05；與D2組比較，5）P＜0.05 ATP A組

3 討 論

近年來對肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理在腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用方面的研究較多，但對于其具體作用機(jī)制方面的研究較少。本課題通過觀察大鼠肢體反復(fù)短暫缺血預(yù)處理時(shí)腦組織SOD、MDA及ATP酶水平的影響，探討其在腦缺血及缺血再灌損傷中可能的保護(hù)作用，以指導(dǎo)臨床中腦缺血患者的治療，提高患者的生存率，減少復(fù)發(fā)率及致殘率，提高患者的生存質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)通過LIP后對大鼠腦組織MDA、SOD含量及ATP酶活性變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察LIP在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，結(jié)果顯示大鼠腦缺血再灌注時(shí)大腦出現(xiàn)明顯損傷性改變，經(jīng)過股動脈反復(fù)4次短暫（10min）夾閉的LIP可使1d內(nèi)腦缺血引起的神經(jīng)元損傷有所改善，即通過觀察肢體反復(fù)短暫缺血再灌注0h、6h、12h、24h大鼠腦組織 MDA、SOD、ATP的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復(fù)短暫肢體缺血再灌注后大鼠腦組織中 MDA、ATP早期即有明顯的升高，12h、24h升高不明顯。這些結(jié)果表明LIP可以對遠(yuǎn)隔器官腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生對抗作用，但間隔時(shí)間過長，LIP的這種保護(hù)作用有所減弱。這與Lepore等［3］研究發(fā)現(xiàn)大鼠后肢損傷性缺血前1d給予缺血預(yù)處理不能改善肌肉的生存狀況，認(rèn)為LIP對后續(xù)的肢體缺血再灌注損傷不能產(chǎn)生延遲性保護(hù)作用結(jié)果相一致。分析其相關(guān)機(jī)制可能為：①腦缺血后血流重建時(shí)缺血區(qū)自由基增多，與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)［4］，分解產(chǎn)生MDA，使腦組織生物膜結(jié)構(gòu)破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂、透明質(zhì)酸解聚、細(xì)胞崩解，腦細(xì)胞發(fā)生不可逆性損害，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。②SOD作為體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，通過清除超氧陰離子自由基保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷。③腦缺血再灌注早期，腦細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，依賴ATP的離子泵，尤其是Na＋－K＋－ATPase功能減弱，使大量Na＋內(nèi)流，K＋外流，細(xì)胞膜電位下降產(chǎn)生去極化，從而引起突觸前膜釋放興奮性氨基酸，興奮性氨基酸主要通過受體活化方式而起興奮性介質(zhì)作用，受體活化效應(yīng)主要引發(fā)大量的Ca2＋內(nèi)流，同時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2＋庫的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋超載，激活了各種降解酶，引起DNA、蛋白質(zhì)和磷脂降解，細(xì)胞代謝、結(jié)構(gòu)與功能多方面的異常改變，神經(jīng)細(xì)胞逐步死亡。有文獻(xiàn)表明，細(xì)胞內(nèi)Na＋增多，導(dǎo)致滲透壓升高，是再灌注早期腦細(xì)胞內(nèi)水腫和神經(jīng)細(xì)胞壞死的重要原因［5］。同時(shí)過量Ca2＋沉積于線粒體，使線粒體氧化磷酸化失偶聯(lián)進(jìn)一步加重，膜電位喪失，導(dǎo)致細(xì)胞能量的嚴(yán)重丟失，同時(shí)致使O2經(jīng)單電子還原生成超氧陰離子（O2－）增多，產(chǎn)生的大量自由基引起膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，線粒體功能障礙，細(xì)胞膜通透性也增加，發(fā)生細(xì)胞溶解和組織水腫等一系列損害作用。此外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，LIP能明顯對抗后續(xù)即刻給予的損傷性腦缺血再灌注引起的大鼠海馬CA1區(qū)延遲性神經(jīng)元死亡，并從LIP后NO動態(tài)變化、C－Fos、Hsp蛋白的表達(dá)，神經(jīng)途徑闡釋了LIP對腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制［6－8］。

反復(fù)短暫肢體缺血預(yù)處理是一種便捷、安全、有效的腦保護(hù)方法，對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加自由基清除酶SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低MDA含量有關(guān)。通過促進(jìn)腦缺血再灌注后線粒體脂肪酸代謝，提高糖代謝，加速ATP產(chǎn)生，及早恢復(fù)缺血半暗區(qū)能量供應(yīng)，阻斷后續(xù)的鏈?zhǔn)缴窠?jīng)元損傷反應(yīng)，產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。Na＋－K＋－ATPase活性升高可糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒，Ca2＋－Mg2＋－ATPase活性升高可糾正Ca2＋超載，反復(fù)短暫肢體缺血預(yù)處理通過提高腦缺血再灌注后 Na＋－K＋－ATPase和Ca2＋－Mg2＋－ATPase活性，維持鈉泵、鈣泵的穩(wěn)定，使細(xì)胞內(nèi)外Na＋、Ca2＋平衡，從而穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞膜電位，起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

雖然本實(shí)驗(yàn)將預(yù)處理組區(qū)分了四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，但LIP對缺血再灌腦保護(hù)的具體時(shí)間窗有待進(jìn)一步研究，在以后的試驗(yàn)中需更詳細(xì)的制定時(shí)間窗以及對其他相關(guān)機(jī)制進(jìn)一步研究。

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