張熙桐，關(guān)博元，孔繁華，劉 彪，陶冬冰，武俊瑞,*，岳喜慶,*

人乳、牛乳、羊乳中乳清部分氨基酸組成及乳清蛋白中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的對比

張熙桐1，關(guān)博元1，孔繁華1，劉 彪2，陶冬冰1，武俊瑞1,*，岳喜慶1,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

采用全自動(dòng)氨基酸分析儀分別測定人乳、牛乳、羊乳氨基酸組成。應(yīng)用模糊識別法和氨基酸比值系數(shù)、氨基酸比值系數(shù)分等指標(biāo)全面評價(jià)3 種乳乳清部分營養(yǎng)價(jià)值。采用傅里葉紅外光譜的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶測定3 種乳中乳清蛋白的天然二級構(gòu)象。結(jié)果表明：羊乳乳清部分必需氨基酸與總氨基酸比值為0.450，全雞蛋蛋白貼近度與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織貼近度分別為0.919 7、0.925 0，2 種氨基酸比值系數(shù)分分別為68.47、76.56，在氨基酸營養(yǎng)評價(jià)上營養(yǎng)價(jià)值較高。羊乳乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋比例為20.26%，與人乳的27.37%更為接近，一定程度上更利于人體吸收。因此，羊乳是相比牛乳較好的嬰幼兒功能性食品原料。

氨基酸；營養(yǎng)評價(jià)；乳清蛋白；傅里葉變換紅外光譜；二級結(jié)構(gòu)

人乳是天然的、最理想的哺育嬰幼兒的食品，它含有人體所需的全部營養(yǎng)成分，以及多種生物活性成分，在嬰幼兒生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。牛乳是人類利用最多的動(dòng)物乳，占乳制品消費(fèi)量的95%[4]。牛乳主要由水、蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)等組成，為人體提供必需營養(yǎng)物質(zhì)，且其中乳清蛋白約占20%[5-6]。羊乳的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和各項(xiàng)營養(yǎng)元素配比均與人乳相類似，其總熱量、干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪以及礦物質(zhì)含量均高于牛乳，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[6-9]。

乳清蛋白必需氨基酸種類齊全，組成模式與人體相似，容易消化吸收，具有極高的生物利用效價(jià)；乳清蛋白功能多樣，來源于天然食品，是可獲得的最經(jīng)濟(jì)的食物蛋白質(zhì)資源之一[10-12]。目前，傅里葉變換紅外光譜已成為對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的常規(guī)方法，但國內(nèi)外針對人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析還較少。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的主要成分和基本單位，評價(jià)營養(yǎng)價(jià)值高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)就是食品中的氨基酸含量與種類是否豐富與齊全，而氨基酸自動(dòng)分析儀早已被國內(nèi)外專用于分析測定食品中的氨基酸含量[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)采用L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀對人乳、牛乳、羊乳中乳清部分氨基酸組成進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。采用傅里葉變換紅外光譜法對人乳、牛乳、羊乳分離出的乳清蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的分析，分析結(jié)果采用OMNIC 8.2及Peakfit 4.0進(jìn)行定性、定量分析。深入了解人乳、牛乳、羊乳在以上兩方面的異同點(diǎn)，為日后生產(chǎn)嬰幼兒食品及功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳、羊乳均采集自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧場。

采集30 份健康奶牛、奶羊的乳汁低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行混合（防止個(gè)體差異）。除當(dāng)天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外，其余乳樣均置于-80 ℃冰柜冷藏。

人乳：采集某醫(yī)院正常生產(chǎn)、身體健康、頭胎、飲食正常的30 位授乳母親的乳汁低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行混合（防止個(gè)體差異）。除當(dāng)天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外，其余乳樣均置于-80 ℃冰柜冷藏。由授乳母親自愿提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-21G高速冷凍離心機(jī)、L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；Nexus 670傅里葉變換紅外光譜儀美國Nicolet公司；真空冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸組成測定

前處理：分別取人乳、牛乳、羊乳各2 mL，4 ℃、6 000×g離心20 min，去除乳脂層，再15 000×g離心60 min，獲得乳清部分，除去酪蛋白[15]。處理后樣品加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液及幾滴消泡劑。抽真空狀態(tài)下（游離氨基酸易氧化）以熔焊機(jī)封口，置于110 ℃烘干箱中水解24 h。冷卻后液體轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，反復(fù)沖洗水解管、漏斗、玻璃棒等，定容至50 mL。取定容后溶液2 mL至蒸發(fā)皿中，100 ℃水浴鍋加熱蒸干，加入2 mL 0.02 mol/L鹽酸[16]。

色譜條件：分析柱：2622C磺酸型的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂；柱溫57 ℃；流動(dòng)相：pH 3.2、3.3、4.3、4.9檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；流動(dòng)相泵1流速0.40 mL/min；泵壓95.000 kgf/cm2；茚三酮泵2流速0.350 mL/min；泵壓12.000 kgf/cm2；紫外檢測器：脯氨酸在波長440 nm處測定吸光度，其他氨基酸在波長570 nm處測定吸光度[17]。

1.3.2 氨基酸的營養(yǎng)評價(jià)

模糊識別法[18]：以全雞蛋蛋白模式和聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）模式為標(biāo)準(zhǔn)，按照蘭氏距離法識別對象u和標(biāo)準(zhǔn)蛋白a的貼近度，如公式（1）所示：

式中：μ為待評價(jià)的蛋白，μ（u1，u2，u3）分別代表人乳蛋白、牛乳蛋白、羊乳蛋白；ak表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白的7 種必需氨基酸（essential amino acids，EAA）含量/（mg/g Pro），即P（a）=P（al，a2，a3，a4，a5，a6，a7）=P1（54，86，70，57，93，47，66）=P2（40，70，55，35，60，40，50），其中P1代表FAO/WHO模式、P2代表全雞蛋蛋白模式，al～a7分別代表異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、含硫氨基酸——蛋氨酸＋半胱氨酸（Met＋Cys）、苯丙氨酸＋酪氨酸（Phe＋Tyr）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）；uik為第i種乳蛋白中的第k種氨基酸的含量（mg/g Pro），u1k、u2k、u3k分別表示這3 種乳蛋白的7 種EAA含量/（mg/g Pro）。

氨基酸比值系數(shù)（ratio coefficient，RC）法[19-20]：根據(jù)FAO/WHO提出的EAA標(biāo)準(zhǔn)模式與全雞蛋蛋白標(biāo)準(zhǔn)模式為參考，分別計(jì)算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、RC、比值系數(shù)分（score of ratio coefficient，SRC）。按公式（2）～（4）計(jì)算：

式中：SRD為RC的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.3 二級結(jié)構(gòu)的測定

樣品前處理：取人乳、牛乳、羊乳各50 mL，4 ℃、6 000×g離心20 min，去除乳脂層，再置于15 000×g離心60 min，獲得乳清部分，除去酪蛋白，置入真空冷凍干燥機(jī)制得凍干粉。

譜圖收集：分別取人、牛、羊樣品粉末1 mg，加入150 mg溴化鉀粉末，研磨混勻后進(jìn)行壓片處理，處理后及時(shí)上樣測試[21]。

譜圖處理：使用OMNIC 8.2軟件，對樣品譜圖在譜帶范圍內(nèi)（酰胺Ⅲ帶1 220～1 330 cm-1；酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1）進(jìn)行基線校正，采用5點(diǎn)Savitsk Golay函數(shù)平滑后，進(jìn)行傅里葉去卷積。處理后圖譜在Peakfit 4.0軟件中，采用Gausse函數(shù)進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)分峰擬合，多次擬合使殘差R2最小，當(dāng)確定了各子峰與不同二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計(jì)算各種二級結(jié)構(gòu)的相對百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸分析

2.1.1 氨基酸組成分析

表1 不同乳之間氨基酸含量的比較Table 1 Comparison of amino acid composition of whey proteins in different milks mg/g Pro

如表1所示，人乳、牛乳、羊乳中氨基酸總量分別為752.15、870.62、887.15 mg/g Pro，少于寧健婷等[18]所測得的3 種初乳中氨基酸含量為833.9、904.6、954.5 mg/g Pro。EAA與總氨基酸（total amino acids，TAA）含量比值均與FAO/WHO提出的EAA/TAA為0.400相接近，這也與寧健婷等[18]的數(shù)據(jù)大致相符。這表明3 種乳乳清部分氨基酸含量豐富，種類齊全，富含17 種氨基酸，在氨基酸層面均具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，但相對初乳來說營養(yǎng)含量還是較低，這也說明初乳相對于常乳還是更有營養(yǎng)。

3 種乳乳清部分中含量最高的2 種氨基酸均為谷氨酸與亮氨酸。谷氨酸可與血氨形成谷氨酰胺，它的作用是清除有毒化合物，此外它還可以為腦細(xì)胞提供營養(yǎng)[22]。亮氨酸可以調(diào)控機(jī)體的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，包括維持機(jī)體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，清除衰老和損傷的各類蛋白，合成熱休克和免疫相關(guān)蛋白，參與組織修復(fù)和更新，并響應(yīng)各種營養(yǎng)和激素信號等[23]。兩者均是對人體非常有益的化合物。

2.1.2 模糊識別分析

表2 人乳、牛乳、羊乳蛋白相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的貼近度Table 2 Closeness of whey proteins in human, bovine and goat milks to standard proteins

由公式（1）對模糊識別法的計(jì)算可知，人乳、牛乳、羊乳與FAO/WHO模式和全雞蛋蛋白模式的貼近度，如表2所示。人乳FAO/WHO模式貼近度遠(yuǎn)高于大豆蛋白（FAO/WHO模式貼近度0.896），牛乳與羊乳FAO/WHO模式貼近度與大豆蛋白相接近[24]。3 種乳的全雞蛋蛋白貼近度均在0.900附近，與雞蛋蛋白貼近度相近。表明3 種乳都有較高的營養(yǎng)價(jià)值，人乳營養(yǎng)價(jià)值相對較高，羊乳次之。

2.1.3 RC法分析

RC法是基于氨基酸平衡理論設(shè)計(jì)的評價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的方法，如果氨基酸的含量豐富且與FAO/WHO提出的標(biāo)準(zhǔn)模式相近，說明這種蛋白質(zhì)接近人體所需的氨基酸比例，能為人體所利用的營養(yǎng)價(jià)值越高[25]。

表3 人乳、牛乳、羊乳蛋白質(zhì)的RAA、RC、SRC的比較（FAO/WHO模式）Table 3 RAA, RC and SRC of whey proteins in human, bovine and goat milks in the FAO/WHO protein pattern

表4 人乳、牛乳、羊乳蛋白質(zhì)的RAA、RC、SRC的比較（全雞蛋蛋白模式）Table 4 RAA, RC and SRC of whey proteins in human, bovine and goat milks in the whole egg pattern

RAA及RC的數(shù)值越接近1，說明該種初乳蛋白與全雞蛋蛋白模式（FAO/WHO模式）中EAA推薦值越接近。當(dāng)RC大于1，說明此種EAA超過標(biāo)準(zhǔn)模式，相對過剩；當(dāng)RC小于1，說明此種EAA低于全雞蛋蛋白模式，相對不足。SRC越接近100，說明該種蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值越高，為人體吸收的概率越大。

從表3、4可知，3 種乳中不同EAA的RAA和RC值大多在1附近，說明營養(yǎng)條件滿足人體需要。2 種不同模式分析條件下，羊乳SRC都是最高，表明羊乳對于人體吸收利用來說營養(yǎng)價(jià)值最高，是嬰幼兒功能食品良好的原料。3 種乳中的第1限制氨基酸均為纈氨酸，可根據(jù)蛋白質(zhì)互補(bǔ)法[26]，與其他食物蛋白混合利用，從而有效提高不同食物的營養(yǎng)利用價(jià)值。

2.2 乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

如圖1所示，經(jīng)傅里葉變換紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，3 種乳走勢大致相同，說明實(shí)驗(yàn)無明顯偏差。將原譜通過OMNIC及Peakfit軟件進(jìn)行處理后，如圖2所示，在酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）通過分析得出3 種乳二級結(jié)構(gòu)的分類和比例，如表5所示，對于酰胺Ⅰ帶不易區(qū)分的α-螺旋結(jié)構(gòu)與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，進(jìn)行酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm-1）分析確定α-螺旋的含量（表6）[27]。結(jié)果顯示：從α-螺旋結(jié)構(gòu)來比較人乳最多，羊乳次之，牛乳最少。而從β-轉(zhuǎn)角與β-折疊結(jié)構(gòu)來比較則恰好與α-螺旋結(jié)構(gòu)相反。

α-螺旋是蛋白質(zhì)中常見的二級結(jié)構(gòu)，肽鏈主鏈繞假想的中心軸盤繞成螺旋狀，螺旋靠鏈內(nèi)氫鍵維持。α-螺旋在蛋白質(zhì)相互作用中具有重要性[28]。α-螺旋可使肽鏈的長度大為縮短，即延伸性較大，同時(shí)，α-螺旋也是球狀蛋白質(zhì)構(gòu)象中最為常見的螺旋盤曲形式。α-螺旋結(jié)構(gòu)對于人體有重要作用。例如，α-螺旋跨膜蛋白具有跨越細(xì)胞膜磷脂雙分子層的特性，能夠穿透生物膜滲透性屏障，因此在許多重要的細(xì)胞生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，包括信號和能量轉(zhuǎn)換、主動(dòng)運(yùn)輸、離子流動(dòng)以及神經(jīng)傳導(dǎo)等[29-30]。因此，較多的α-螺旋，在一定程度上對人體更有利。

圖1 人乳（a）、牛乳（b）和羊乳（c）乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的紅外光譜圖Fig. 1 Infrared spectra of whey proteins of human, bovine and goat milks

圖2 人乳（a）、牛乳（b）和羊乳（c）酰胺Ⅰ帶擬合效果Fig. 2 Curve-fitting results of amides I band in infrared spectra of whey proteins in human, bovine and goat milks

表5 酰胺Ⅰ帶分析結(jié)果Table 5 Secondary structure estimation based on amide I band

表6 酰胺Ⅲ帶對α-螺旋的分析結(jié)果Table 6 Analysis of α- helix based on amide III band

β-轉(zhuǎn)角是最常見的數(shù)量最大的轉(zhuǎn)角，一個(gè)β-轉(zhuǎn)角包含4 個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，其中VIa1、VIa2和VIb類的第i＋2個(gè)殘基為脯氨酸，另外轉(zhuǎn)角Ⅱ的第3個(gè)殘基往往是甘氨酸[31-32]。研究表明，甘氨酸和脯氨酸的存在，不利于α-螺旋的穩(wěn)定[33]。因此，較多的β-轉(zhuǎn)角會一定程度上影響α-螺旋所占比例，進(jìn)而間接影響人體的吸收利用。如表5所示，人乳中α-螺旋比例最高β-轉(zhuǎn)角比例最少，而牛乳完全相反，羊乳介于兩者之間，表明羊乳更利于人體的吸收利用。同時(shí)，根據(jù)表1氨基酸組分的分析可知，牛、羊乳中甘氨酸含量與人乳相近，脯氨酸含量較高，這也與分析結(jié)果相印證。

3 結(jié) 論

通過分析3 種乳中的氨基酸組成以及上述幾種氨基酸營養(yǎng)評價(jià)方法結(jié)果可知，3 種乳中均氨基酸含量豐富，種類齊全，富含17 種氨基酸，EAA/TAA均與FAO/WHO提出的EAA/TAA值為0.400相接近。FAO/WHO模式貼近度人乳最高為0.944 5，羊乳次之為0.925 0，全雞蛋蛋白模式貼近度羊乳最高為0.919 7。3 種乳中不同EAA的RAA和RC值大多在1附近，說明營養(yǎng)條件滿足人體需要，其中羊乳SRC均為最高。以上結(jié)果均表明羊乳相對牛乳來說，營養(yǎng)價(jià)值更高，更利于人體吸收。

以酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅲ帶對幾種不同二級結(jié)構(gòu)的分區(qū)結(jié)果可知，人乳乳清蛋白中α-螺旋含量最高，為27.37%，羊乳次之為20.26%，而人乳乳清蛋白中β-轉(zhuǎn)角與β-折疊含量均為最少，羊乳次之。上述結(jié)果表明，羊乳乳清蛋白與人乳乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)更為貼近，在一定程度上會利于人體的吸收。綜合氨基酸組成分析、氨基酸營養(yǎng)評價(jià)以及乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析可知，羊乳是相對于牛乳更好的人乳替代品和嬰幼兒功能食品原料。

目前，蛋白質(zhì)的二級研究已較為普遍，但對于乳清蛋白的二級結(jié)構(gòu)研究較少。本次實(shí)驗(yàn)通過對3 種乳乳清部分氨基酸組成分析與乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析相結(jié)合，探究3 種乳的異同，以期能夠?yàn)槠渌嚓P(guān)課題研究人員提供數(shù)據(jù)參考，同時(shí)也為日后更深入的研究探索提供理論依據(jù)。

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Comparative Study of Amino Acid Composition and Secondary Structure of Whey Proteins in Human Milk,Cow Milk, and Goat Milk

ZHANG Xitong1, GUAN Boyuan1, KONG Fanhua1, LIU Biao2, TAO Dongbing1, WU Junrui1,*, YUE Xiqing1,*
(1. College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;2. Inner Mongolia Yili Industrial Co. Ltd., Hohhot 010050, China)

This study adopted an automatic amino acid analyzer to measure the amino acid composition of whey proteins in human milk, bovine milk and goat milk. The nutritional value was comprehensively evaluated by the fuzzy recognition method based on ratio coefficient of amino acid (RCAA) and score of ratio coefficient amino acid ratio coefficient score(SRCAA). The secondary structure of whey proteins was measured based on the amide I and amide III bands in Fourier transform infrared (FTIR) spectra. Results showed that the ratio of essential amino acids to total amino acids (EAA/TAA) in goat whey proteins was 0.450, showing a 0.919 7 and 0.925 0 similarity to whole egg protein and United Nations Food and Agriculture Organization/World Health Organization (FAO/WHO) reference protein, respectively, and the SRCAA values were 68.47 and 76.56, respectively in the two patterns indicating high nutritional value. The proportion of α-helix structure in goat whey proteins was 20.26%, which is much closer to that of human whey proteins (27.37%) indicating greater ease of absorption by the human body. Therefore, goat milk is a better source of functional foods for infants and young children.

amino acid; nutritional evaluation; whey protein; Fourier transform infrared (FTIR); secondary structure

10.7506/spkx1002-6630-201724017

TS252.51

A

1002-6630（2017）24-0107-06

張熙桐, 關(guān)博元, 孔繁華, 等. 人乳、牛乳、羊乳中乳清部分氨基酸組成及乳清蛋白中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的對比[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24): 107-112.

10.7506/spkx1002-6630-201724017. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xitong, GUAN Boyuan, KONG Fanhua, et al. Comparative study of amino acid composition and secondary structure of whey proteins in human milk, cow milk, and goat milk[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 107-112. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724017. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-12

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題（2013BAD18B03-02）

張熙桐（1993—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品加工。E-mail：546442323@qq.com

*通信作者：武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品加工。E-mail：junruiwu@126.com

岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品加工。E-mail：yxqsyau@126.com