吳濤，趙津津，毛賢軍

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大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(tǒng)改造對產L-色氨酸的影響

吳濤，趙津津，毛賢軍

梅花生物科技集團股份有限公司廊坊梅花生物技術開發(fā)有限公司，河北廊坊 065001

吳濤，趙津津，毛賢軍. 大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(tǒng)改造對產L-色氨酸的影響. 生物工程學報, 2017, 33(11): 1877–1882.Wu T, Zhao JJ, Mao XJ. Effect of PTS modifications on L-tryptophan production in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1877–1882.

L-色氨酸是芳香族氨基酸的一種，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和飼料等領域。大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(tǒng) (PTS系統(tǒng)) 在葡萄糖轉運和磷酸化過程中起重要作用，是糖代謝基因表達調控的核心。利用Red同源重組系統(tǒng)，構建包含兩類典型PTS系統(tǒng)突變 (-+和-) 的L-色氨酸生產菌，并對相關菌株進行補料分批發(fā)酵研究。結果表明，不同類型PTS系統(tǒng)突變對菌體生長、L-色氨酸產量、糖酸轉化率及副產物生成均有較大影響。與出發(fā)菌相比，-+突變株最高600達到125，提高47.0%，產酸38.5 g/L，提高25.9%，糖酸轉化率16.7%，提高26.5%，乙酸生成略有增加；-突變株最高600達到100，提高17.6%，產酸33.4 g/L，提高9.4%，糖酸轉化率15.5%，提高17.4%，乙酸生成略有減少。對葡萄糖轉運系統(tǒng)的進一步研究將為大腸桿菌合成L-色氨酸效率的提升提供幫助。

大腸桿菌，L-色氨酸，PTS系統(tǒng)，補料分批發(fā)酵

L-色氨酸是芳香族必需氨基酸的一種，被廣泛應用于飼料、醫(yī)藥和食品等領域。目前L-色氨酸的合成效率偏低，高昂的價格嚴重限制了其應用規(guī)模。提高L-色氨酸的生物合成效率、降低生產成本具有重要的應用價值。L-色氨酸生物合成途徑復雜，前體來源于糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑及三羧酸循環(huán)等多個基礎代謝途徑。每合成1 mol L-色氨酸需要 1 mol磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和1 mol 4-磷酸赤蘚糖 (E4P) 作為起始前體，另外還需分別消耗PEP、谷氨酰胺、5-磷酸核糖焦磷酸 (PRPP) 和絲氨酸各 1 mol[1]。因此，研究色氨酸合成代謝對研究微生物代謝平衡具有重要的科學意義。

1979年，Tribe等[2]利用DNA重組技術首次將基因引入大腸桿菌，L-色氨酸產量達到1 g/L。此后，隨著代謝工程改造的深入和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，利用重組大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產L-色氨酸的效率得到了數十倍的提升[3–7]。1996年，Berry[3]在大腸桿菌中高表達去除反饋抑制 (Feed-back resistance，fbr) 的fbr、fbr基因，發(fā)酵52 h產L-色氨酸近45 g/L，過程最高糖酸轉化率約為22%。1999年，Ikeda等[4]在產L-色氨酸的谷氨酸棒桿菌pIK9960中高表達基因，增加L-色氨酸合成前體E4P的水平，從而提高L-色氨酸的合成效率，發(fā)酵80 h的L-色氨酸產量達到58 g/L。2012年，Cheng等[7]通過對產L-色氨酸大腸桿菌TRJH的發(fā)酵補料策略優(yōu)化，發(fā)酵40 h左右，產量達到38.8 g/L，糖酸轉化率高達19.9%。

大腸桿菌可通過多種途徑轉運并磷酸化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，然后將其導入糖酵解途徑。野生型大腸桿菌利用磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(tǒng)(簡稱PTS系統(tǒng)) 轉運并磷酸化葡萄糖。PTS系統(tǒng)由EⅠ、HPr和EⅡs構成，EⅠ、HPr分別由、基因編碼，為胞質可溶性蛋白；EⅡs包括EⅡMan、EⅡFru、EⅡBgl、EⅡAGlc、EⅡCBGlc等，多為蛋白復合體，對碳水化合物具有特異性，其中EⅡAGlc、EⅡCBGlc分別由、基因編碼[8-9]。PTS系統(tǒng)轉運1 mol葡萄糖需消耗1 mol PEP[9-10]。當大腸桿菌在以葡萄糖為碳源的限制性培養(yǎng)基中生長時，PTS系統(tǒng)消耗了約50%的PEP用于葡萄糖的轉運和磷酸化[11]，直接影響以PEP為前體的化合物 (如莽草酸、芳香族氨基酸、天冬氨酸族氨基酸等) 的合成。在PTS系統(tǒng)缺陷大腸桿菌中，葡萄糖可以通過半乳糖/氫離子協(xié)同轉運蛋白 (D-Galactose/H+symporter，GalP) 和葡萄糖激酶 (Glucokinase，Glk)協(xié)同作用進入胞內[9-11]，以ATP為磷酸基團供體，但以GalP、Glk協(xié)同作用磷酸化轉運葡萄糖的效率較低[11]。另外，大腸桿菌也可通過引入外源高效的葡萄糖轉運磷酸化系統(tǒng)，如運動假單胞菌來源的、基因，分別編碼葡萄糖轉運蛋白 (Glucose facilitator，Glf) 和葡萄糖激酶 (Glk)，以ATP為磷酸基團供體，轉運并磷酸化葡萄糖[11-12]。

PTS系統(tǒng)改造的大腸桿菌被廣泛應用于多種化合物的發(fā)酵生產，如莽草酸、苯丙氨酸、乙醇等[11-12]。對于PTS系統(tǒng)的修飾改造可分為3類：-、PTS-Glc+(-突變菌經進化獲得可在葡萄糖為碳源的限制性培養(yǎng)基上生長的Glc+表型) 和PTS-+(-突變菌通過表達外源、基因獲得Glc+表型)[11]。本研究采用Red同源重組系統(tǒng)，構建了兩類典型的PTS系統(tǒng)突變體-+和-，將其應用于產L-色氨酸生產菌的構建，PTS系統(tǒng)突變后，葡萄糖轉運將不再消耗PEP，胞內色氨酸重要前體物PEP的水平提高1倍，色氨酸生產能力有望顯著提高。本研究還對不同PTS系統(tǒng)改造菌株的生產性能進行了補料分批發(fā)酵初步研究，首次綜合評價了不同類型PTS系統(tǒng)改造對大腸桿菌產L-色氨酸的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究使用的菌株和質粒見表1。產L-色氨酸大腸桿菌MA01為出發(fā)菌，公開保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 6863，根據專利WO8701130A1[13]及Mascarenhas等[14]描述的方法構建，其宿主菌SA01為K-12 CICC 10303衍生的K-12 CICC 10303 ??，所含質粒pMG43為pBR322來源，包含有、fbr和fbr基因。

表1 本研究使用的菌株和質粒

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，15 g/L酵母浸粉，10 g/L (NH4)2SO4，0.5 g/L檸檬酸鈉，5 g/L MgSO4·7H2O，1.5 g/L KH2PO4，15 mg/L FeSO4·7H2O，1.2 mg/L VB1，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g/L葡萄糖，1 g/L酵母浸粉，4 g/L (NH4)2SO4，2 g/L檸檬酸鈉，5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L KH2PO4，0.1 g/L FeSO4·7H2O，6.3 mg/L MnSO4·H2O，7.4 mg/L ZnSO4·H2O，5.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.8 mg/L CuSO4·5H2O，pH 7.0。

1.3 主要試劑

Phusion?High-Fidelity DNA聚合酶購于NEB公司，限制性內切酶和T4 DNA連接酶購于Fermentas公司，質粒提取試劑盒和DNA回收試劑盒購于Tiangen公司，L-色氨酸、有機酸標準品購于Sigma-Aldrich公司。其他化學試劑均為國產或進口分析純。

1.4 質粒載體構建

采用常規(guī)分子克隆技術[17]，如PCR擴增、酶切、連接和轉化等構建重組質粒pMG56，具體方法如下，所用引物序列見表2。

1.4.1 質粒載體pET28-glfglk的構建

以質粒pSC6.090B為模板，用引物glfglk1和 glfglk2擴增約2.3 kb的FK1片段，用引物glfglk3和glfglk4擴增約1.0 kb的FK2片段。以FK1和FK2為模板，用引物glfglk1和glfglk4擴增約3.3 kb的DNA片段，產物用Ⅰ、Ⅰ雙酶切，與經同樣酶切的質粒pET28a連接，產物轉化Top10感受態(tài)細胞，轉化子用glfglk1和glfglk4為引物PCR鑒定，陽性約3.3 kb。提取重組質粒，用Ⅰ、Ⅰ雙酶切鑒定，所得重組質粒pET28-glfglk約8.3 kb。

1.4.2 重組質粒pMG56的構建

質粒pET28-glfglk用Ⅰ、Ⅰ雙酶切，回收約3.3 kb的DNA片段，與經同樣酶切的質粒pMG43連接，產物轉化Top10感受態(tài)細胞，轉化子用glfglk1和glfglk4為引物PCR鑒定，陽性約3.3 kb。提取重組質粒，用Ⅰ、Ⅰ雙酶切鑒定，所得重組質粒pMG56約15.8 kb。

1.5 突變菌的構建

采用Datsenko KA等[15]所述的Red同源重組方法構建突變菌株，具體方法如下。

1.5.1基因敲除菌的構建

以質粒pKD4為模板，pts1和pts2為引物，PCR擴增約1.5 kb的突變基因，電擊轉化100 μL含有質粒pKD46的SA01感受態(tài)細胞，30 ℃孵育 1–2 h，涂布含卡那霉素(25 μg/mL)的LB平板，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，挑單克隆以pts3和pts4為引物菌落PCR鑒定，陽性約1.5 kb，所得菌株即為基因的突變菌株SA01 ?::。

表2 本研究使用的引物

The coding region are underlined, the restriction sites are indicated by bold letters.

將質粒pCP20電擊轉化菌株SA01 ?::，菌液涂布含氯霉素(25 μg/mL)的LB平板，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。得到的單菌落轉接無抗LB平板，42 ℃靜置培養(yǎng)12 h，以pts3和pts6為引物進行菌落PCR鑒定，陽性約0.5 kb，所得菌株即為基因敲除的重組菌株SA01-。

1.5.2基因敲除菌的構建

與基因敲除菌的構建方法相同。

1.6 培養(yǎng)條件

搖瓶培養(yǎng)：從凍存管取菌種在LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h；將菌體接種至裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，37 ℃、240 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將過夜培養(yǎng)的菌液接種至50 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、240 r/min振蕩培養(yǎng)5–10 h，600控制在6–8；將菌液轉接至裝有10 L種子培養(yǎng)基的 20 L發(fā)酵罐，36 ℃培養(yǎng)9–18 h，600控制在13–18，溶氧控制在30%以上，pH控制在6.8–7.0；取2.2 L菌液轉接至裝有20 L發(fā)酵培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐，35 ℃培養(yǎng)40–45 h，溶氧控制在10%–20%，轉速200– 800 r/min，罐壓0.05–0.10 MPa，pH 6.5–6.6，待初 糖耗盡后，流加60% (/) 葡萄糖，流加糖速率為3–17 g/(L·h)。

1.7 葡萄糖、L-色氨酸及其他有機酸含量的測定

取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心3 min，測定上清液中葡萄糖、L-色氨酸及有機酸的含量。葡萄糖采用SBA-40C生物傳感分析儀 (山東省科學院) 進行測定。L-色氨酸及有機酸分別采用HPLC法進行測定[18–19]。

2 結果與分析

2.1 L-色氨酸生產菌的構建

按1.4所述方法，構建重組質粒pMG56。按1.5所述方法，分別構建了缺失突變株SA09和缺失突變株SA29。以SA09為宿主轉化質粒pMG43或pMG56，分別構建了L-色氨酸生產菌MA10和MA103；以SA29為宿主轉化質粒pMG43，構建了L-色氨酸生產菌MA209。

2.2 PTS系統(tǒng)改造對L-色氨酸生產菌生長的影響

MA01、MA10 (-)、MA103(-+) 、MA209 (-) 按1.6所述的方法進行搖瓶培養(yǎng)，每2 h取樣，測定生長曲線 (圖1)，重復實驗3次。與出發(fā)菌MA01相比，缺失突變株MA10葡萄糖攝入能力差，生長緩慢；在MA10內引入、基因，獲得的菌株MA103生長旺盛，最高600值達到16.9，較MA01提高了35.6%；缺失突變株MA209，延滯期較出發(fā)菌MA01延長近4 h，但最終600值仍達到14.8，較MA01提高19.4%。

2.3 PTS系統(tǒng)改造對L-色氨酸生產菌發(fā)酵性能的影響

MA01、MA103和MA209按1.6所述的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定各菌株的生長曲線，發(fā)酵液中葡萄糖、L-色氨酸及其他有機酸含量的變化，最終產酸及糖酸轉化率 (圖2)。發(fā)酵過程采用葡萄糖限制補料分批發(fā)酵工藝，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度接近 0 g/L，見圖2A。缺陷株MA103最高600值達到125，較出發(fā)菌MA01提高47.0%；缺陷株MA209雖然前期生長稍慢，最高600值也能達到100，較出發(fā)菌MA01提高17.6%，但32 h后600值有明顯下降的趨勢。

L-色氨酸合成過程及最終產酸、糖酸轉化率如圖2B和2D所示，與出發(fā)菌MA01相比，缺陷株MA103能夠達到的最高產酸為38.5 g/L，提高25.9%，糖酸轉化率為16.7%，提高26.5%；缺陷株MA209最高產酸為33.4 g/L，提高9.4%，糖酸轉化率為15.5%，提高17.4%。

發(fā)酵液中的有機酸副產物，如乙酸、甲酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、莽草酸的含量也進行了測定。結果表明，乙酸含量差別最大，變化趨勢也最明顯，如圖2C所示。缺陷株MA103最高乙酸含量是MA01的2.1倍，達到4.1 g/L，而缺陷株MA209的乙酸含量較MA01低，最高值僅為1.5 g/L。其他有機酸含量偏低，且無顯著變化。

圖1 PTS系統(tǒng)改造L-色氨酸生產菌生長曲線

圖2 PTS系統(tǒng)改造L-色氨酸生產菌的發(fā)酵性能

3 討論

當大腸桿菌在以葡萄糖為碳源的限制性培養(yǎng)基中生長時，PTS系統(tǒng)消耗了約50%的PEP用于葡萄糖的轉運和磷酸化，而用于合成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 (DAHP) 的PEP僅占3%[12,20]，因此將PTS系統(tǒng)替換成利用ATP進行磷酸化的葡萄糖轉運系統(tǒng)，對以PEP為前體的芳香族化合物的生物合成具有重要的應用價值。

然而大腸桿菌PTS系統(tǒng)與碳代謝總體調控蛋白CRP-cAMP緊密關聯(lián)。腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化ATP生成cAMP，其活性受磷酸化的EⅡAGlc(由基因編碼)激活，因此不同類型的PTS系統(tǒng)改造會直接影響胞內cAMP的含量。一般認為-突變體因缺失基因，cAMP含量較低，而-突變體因含有磷酸化的EⅡAGlc，cAMP含量較高[9,12]。在RegulonDB和EcoCyc數據庫(http://regulondb.ccg.unam.mx/ index.jsp和http://biocyc.org/ecocyc/index.shtml) 中，除糖(阿拉伯糖、木糖、乳糖等) 代謝相關基因外，還有131個“簡單”或“復雜”的轉錄單元被CRP-cAMP激活、抑制或雙重調控。這些調控單元與TCA循環(huán)、呼吸、滲透壓調節(jié)、壓力響應、生物膜形成、毒力、氮代謝、鐵的吸收、感受態(tài)能力、多種藥物抗性、非編碼RNA等相關[12]。因此，不同類型PTS系統(tǒng)突變對于不同化合物生物合成的影響可能存在顯著的差異。

本研究首次綜合評價了不同類型PTS系統(tǒng)改造對于大腸桿菌產L-色氨酸的影響。結果表明，不同類型PTS系統(tǒng)突變對菌體生長、L-色氨酸產量、糖酸轉化率及副產物生成均有較大影響，且表型存在較大差異。MA103 (-+) 在發(fā)酵罐中的最高600值能達到120以上，對高密度發(fā)酵產L-色氨酸非常有利，最高產酸達38.5 g/L。但發(fā)酵液中乙酸含量也相對偏高，達到4.1 g/L，這可能與引入的外源基因、的表達強度有關，調整合適的、基因表達水平，將有望降低乙酸的水平，得到L-色氨酸產量更高的重組菌株?；蛘咄ㄟ^優(yōu)化發(fā)酵補料策略，降低乙酸水平[7, 21-22]。

MA209 (-) 因PTS系統(tǒng)被阻斷，PEP不再作為葡萄糖磷酸化的磷酸供體[8-9]，葡萄糖通過半乳糖/氫離子協(xié)同轉運蛋白 (GalP) 和葡萄糖激酶(Glk) 協(xié)同作用進入胞內[9-11]，以ATP為磷酸基團供體，但以GalP、Glk協(xié)同作用磷酸化轉運葡萄糖的效率較低[11]，故MA209菌的葡萄糖攝入系統(tǒng)較弱，延滯期較出發(fā)菌MA01偏長，進入對數中后期，蛋白表達系統(tǒng)已經建立，比生長速率和糖耗速率與MA01菌接近。但MA209菌的葡萄糖攝入水平較弱，不易積累乙酸，有利于發(fā)酵控制。通過增大接種量或優(yōu)化培養(yǎng)基配方等手段可進一步縮短延滯期時長，獲得更高的L-色氨酸產酸和糖酸轉化率。另外，與MA103菌相比，MA209菌需激活自身另一套轉運葡萄糖系統(tǒng)，涉及復雜的代謝調控，代謝調控過程中浪費較多的碳骨架和能量，故而生長速率、轉化效率都會受到影響。

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(本文責編 郝麗芳)

Effect of PTS modifications on L-tryptophan production in

Tao Wu, Jinjin Zhao, and Xianjun Mao

Meihua Biotech (Langfang) Co., Ltd., Meihua Holdings Group, Langfang 065001, Hebei, China

L-tryptophan, one of the aromatic amino acids, is widely used in the fields of medicine, food and feed additives. The phosphoenolpyruvate-carbohydrate phosphotransferase system (PTS) plays an important role in glucose transport and phosphorylation in. PTS-mediated regulation dominates the carbohydrates’ uptake and metabolism in. We constructed L-tryptophan-producing bacteria containing two typical PTS mutations (-+and-) by Red homologous recombination system, and studied in 50 L jar fermenter using fed-batch fermentation. Both PTS system mutants had a great impact on the biomass (increasing 47.0% and 17.6%, respectively), L-tryptophan production (increasing 25.9% and 9.4%, respectively), glucose conversion rate (increasing 26.5% and 17.4%, respectively) and byproduct acetic acid generation (slightly increased and decreased，respectively).

, L-tryptophan, phosphotransferase system, fed-batch fermentation

November 28, 2016;

July 21, 2017

Jinjin Zhao. Tel: +86-316-2359999; E-mail: Zhaojinjin@meihuagrp.com

2017-11-07

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20171107.1128.001.html