劉倩妮，徐美娟，張榮珍，王梅洲，張顯，楊套偉，饒志明,2

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重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸條件優(yōu)化

劉倩妮1，徐美娟1，張榮珍1，王梅洲1，張顯1，楊套偉1，饒志明1,2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

劉倩妮, 徐美娟, 張榮珍, 等. 重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸條件優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(11): 1889–1894.Liu QN, Xu MJ, Zhang RZ, et al. Production of L-citrulline by a recombinant Corynebacterium crenatum SYPA 5-5 whole?cell biocatalyst. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1889–1894.

實(shí)現(xiàn)了精氨酸脫亞胺酶 (ADI) 首次在鈍齒棒桿菌SYPA 5-5中的高效表達(dá)。通過Ni-NTA親和層析純化得到純化ADI，經(jīng)SDS-PAGE測定其分子量約為46.8 kDa，酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)ADI的最適催化溫度為37 ℃，最適pH為6.5，ADI在最佳催化條件下作用于L-精氨酸的米氏常數(shù)為12.18 mmol/L，最大反應(yīng)速率為0.36 μmol/(min·mL)。優(yōu)化了重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)L-瓜氨酸的工藝條件，在最優(yōu)條件下可一次轉(zhuǎn)化300 g/L L-精氨酸，轉(zhuǎn)化速率達(dá)8 g/(L·h)。進(jìn)行重組菌5 L罐發(fā)酵并進(jìn)行罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化300 g/L L-精氨酸，一批菌體可進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化，累計(jì)產(chǎn)量達(dá)1 900 g以上。

精氨酸脫亞胺酶，L-瓜氨酸，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化優(yōu)化，鈍齒棒桿菌

L-瓜氨酸(L-Cit，C6H13N3O3) 是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在人體中易于消化和吸收。研究表明瓜氨酸在炎癥和敗血癥的免疫應(yīng)答中起到至關(guān)重要的作用，減少瓜氨酸在敗血癥和內(nèi)毒素血癥中的利用率將導(dǎo)致死亡率升高，補(bǔ)充瓜氨酸能回復(fù)精氨酸代謝平衡，提高血漿精氨酸濃度，同時(shí)提高NO的含量[1]。瓜氨酸在氮穩(wěn)態(tài)中起到重要作用，它通過精氨酸和谷氨酰胺來抑制氮素循環(huán)中的不適當(dāng)激活；利用瓜氨酸運(yùn)輸NO，能治療新生兒肺動脈高壓癥[2]。瓜氨酸缺乏會導(dǎo)致一些自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和多發(fā)性硬化等[3]。

精氨酸脫亞胺酶 (ADI) 存在于生物體內(nèi)的ADI途徑即精氨酸降解途徑中，此途徑包含3種酶，分別為精氨酸脫亞氨酶 (ADI)、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶 (OTC) 和氨基甲酸酯激酶 (CK)，它們共同作用使1 mol精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸、氨和CO2并釋放出 1 mol ATP，ADI途徑是某些微生物的主要能量來源。

鈍齒棒桿菌SYPA 5-5 (SYPA 5-5)是符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的微生物菌株，發(fā)酵菌體量大，適合用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，主要用于各種氨基酸的生產(chǎn)[4]，且適用于外源酶的高效表達(dá)[5-6]。本研究室前期對該菌株有過較為深入的研究。徐美娟等[7]通過對基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高精氨酸產(chǎn)量；滿在偉等[4,8]通過對該菌株進(jìn)行代謝工程改造，使精氨酸產(chǎn)量得到進(jìn)一步提升。本研究選取糞腸球菌來源的編碼ADI基因連接到表達(dá)載體pXMJ19上，電轉(zhuǎn)化到鈍齒棒桿菌中，構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸合成L-瓜氨酸的重組菌株。本研究首次將ADI在棒桿菌中表達(dá)，為工業(yè)化高效生產(chǎn)L-瓜氨酸提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

.由本實(shí)驗(yàn)室保藏；SYPA 5-5、SYA 5、谷氨酸棒桿菌ATCC 13032由本實(shí)驗(yàn)保藏[9]；表達(dá)載體pXMJ19由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

本研究所用的引物為F：5￠-ACCGGGATC CATGAGTCATCCAATTAATG-3￠(H Ⅰ)和R：5￠-ACCGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATG AAGATCTTCACGGTAAAG-3￠(R Ⅰ)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LBG培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及鈍齒棒桿菌的菌種活化、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)均參照文獻(xiàn)[10]。

1.3 試劑及工具酶

H Ⅰ、R Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、ExDNA聚合酶、dNTPs等購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司；氯霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、L-精氨酸標(biāo)樣、L-瓜氨酸標(biāo)樣購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其他分析純試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 重組菌構(gòu)建

提取.的基因組，PCR擴(kuò)增目的基因，將所得片段割膠回收后，經(jīng)H I和R I雙酶切與經(jīng)過相同雙酶切的表達(dá)載體pXMJ19連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入3種宿主感受態(tài)細(xì)胞中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和電轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)[5]操作。在LBG固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子至LBG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取得到重組質(zhì)粒pXMJ19-，并送至生工生物工程 (上海)股份有限公司測序，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組菌株。

1.5 ADI酶的表達(dá)、純化和酶活測定

將3株重組菌按文獻(xiàn)[4]方法表達(dá)，選擇酶活最高的重組ADI進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。N端帶有組氨酸標(biāo)簽的ADI通過Ni-NTA親和層析，利用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫獲得純化蛋白，將發(fā)酵上清、粗酶液和純化酶液經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分析重組菌表達(dá)和純化結(jié)果。

配制含終濃度0.2 mol/L L-精氨酸的底物緩沖液 (pH 6.5，0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液)，取1.8 mL底物溶液，加入0.2 mL酶液，37 ℃反應(yīng)10 min。將酶反應(yīng)液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后按文獻(xiàn)[11]測定酶活。ADI酶活定義：每分鐘催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化生成1 μmol瓜氨酸的酶量定義為一個(gè)單位ADI酶活力 (1 U)。比酶活定義：每毫克蛋白里包含的酶活數(shù)量 (U/mg)。蛋白濃度采用Bradford法測定[12]。

1.6 L-精氨酸及L-瓜氨酸含量的測定

將轉(zhuǎn)化液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以鄰苯二甲醛(OPA)作為衍生化試劑進(jìn)行氨基酸柱前衍生，利用HPLC進(jìn)行氨基酸含量的測定[13]。

1.7 重組菌C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA搖瓶培養(yǎng)及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸

將重組菌SYPA 5-5/pXMJ19-單菌落在含終濃度10 μg/mL 氯霉素的10 mL LBG液體培養(yǎng)基中于30 ℃活化24 h，并以3%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)入含50 mL LBG的250 mL搖瓶中于30 ℃培養(yǎng)，當(dāng)生長 10 h時(shí)添加終濃度為0.8 mmol/L的IPTG于30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)4 ℃離心收集細(xì)胞，用pH 6.5、0.02 mmol/L磷酸緩沖液洗滌菌體2次，用含300 g/L L-精氨酸 (L-Arg) 的50 mL的底物溶液 (pH 6.5， 0.02 mol/L磷酸緩沖液) 重懸菌體，37 ℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.8 重組菌5 L罐發(fā)酵放大及罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸

重組菌5 L罐發(fā)酵參考文獻(xiàn)[10]方法，發(fā)酵完成后收集全部菌體用pH 6.5、0.02 mol/L磷酸緩沖液洗滌2次，再投入2 L 底物溶液 (pH 6.5，0.02 mol/L磷酸緩沖液，300 g/L L-Arg)，于37 ℃進(jìn)行罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌C. crenatumSYPA 5-5/pXMJ19-arcA的構(gòu)建

提取.的基因組，PCR擴(kuò)增目的基因，按1.5中所述方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-，將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化入SYPA 5-5、SYA 5和ATCC 13032中，對獲取的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)H Ⅰ和R Ⅰ雙酶切驗(yàn)證的大小約為1 200 bp。

2.2 重組ADI的表達(dá)和分離純化

將SYPA 5-5和3株重組菌SYPA 5-5/pXMJ19-、SYA 5/pXMJ19-和ATCC 13032/ pXMJ19-在相同條件下表達(dá)，并測定粗酶液酶活，結(jié)果如表1所示。重組菌SYPA 5-5/pXMJ19-的ADI酶活高于其他菌株，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇該重組菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸的進(jìn)一步研究并對其重組ADI進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。

將SYPA 5-5/pXMJ19-粗酶液進(jìn)行純化，獲得純化ADI結(jié)果如圖1所示。純化酶液在47 kDa左右出現(xiàn)一條蛋白條帶，與ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析理論ADI蛋白大小46.76 kDa相符，測定純化ADI比酶活為 (3.38±0.13) U/mg。

2.3 ADI酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 pH對ADI酶活和酶穩(wěn)定性的影響

將純化ADI在不同pH反應(yīng)體系下反應(yīng)，并將酶液分別置于冰上不同pH條件下分別保溫1 h、 2.5 h、4.5 h、6.5 h測其pH穩(wěn)定性。結(jié)果如圖2A顯示，重組ADI的最適pH為6.5，不同于小眼蟲來源的ADI，它的最適pH為9.7，是一種堿性酶[14]。如圖2B所示重組ADI在pH范圍5.0–7.0之間具有較好的穩(wěn)定性。在最適pH 6.5條件下保存6.5 h仍具有52%相對酶活。但當(dāng)pH>8.0時(shí)，重組酶的穩(wěn)定性迅速降低。

2.3.2 溫度對ADI酶活和酶穩(wěn)定性的影響

將純化ADI在不同溫度反應(yīng)體系下反應(yīng)10 min，結(jié)果如圖3A顯示，此研究中重組ADI的最適溫度為37 ℃，與變形假單胞菌來源的ADI最適溫度相似[15]。將重組酶置于不同溫度下處理研究其熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3B顯示，重 組ADI在37 ℃保存3 h仍具有50%以上相對酶活，并且在高溫50 ℃下保存0.5 h仍具有37%的相對 酶活。

2.3.3 ADI的酶動力學(xué)研究

將重組純酶與含不同摩爾濃度(0.01–0.2 mol/L)的L-Arg底物溶液 (pH 6.5，0.2 mol/L磷酸緩沖液溶液) 在37 ℃反應(yīng)10 min，測定反應(yīng)速度。以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)(1/)，L-Arg摩爾濃度的倒數(shù)(1/[]) 為橫坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖，如圖4得出ADI米氏常數(shù)m為12.18 mmol/L，最大反應(yīng)速率m值為0.36 μmol/(min·mL)。

表1 野生型菌株和重組菌ADI酶活分析

圖1 重組ADI的SDS-PAGE分析

圖2 重組精氨酸脫亞胺酶最適反應(yīng)pH(A)和pH穩(wěn)定性(B)

圖3 重組精氨酸脫亞胺酶最適反應(yīng)溫度(A) 和溫度穩(wěn)定性(B)

圖4 重組精氨酸脫亞胺酶的酶動力學(xué)常數(shù)圖

2.4 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA的 5 L罐發(fā)酵放大研究

2.4.1 初始誘導(dǎo)時(shí)間對重組菌酶活的影響

將重組菌于5 L罐培養(yǎng)，菌體轉(zhuǎn)入罐中后開始添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，設(shè)置其他組依次延后數(shù)小時(shí)添加相同濃度IPTG誘導(dǎo)，每組均于30 ℃誘導(dǎo)12 h。測定誘導(dǎo)時(shí)600，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)4 ℃離心收集細(xì)胞測定酶活。如圖5所示，重組菌生長 0–18 h時(shí)開始誘導(dǎo)，隨著起始誘導(dǎo)時(shí)間的增加，ADI酶活逐漸增加，當(dāng)初始誘導(dǎo)時(shí)間為18 h左右時(shí)開始誘導(dǎo)效果最好，酶活達(dá)0.34 U/mL。但當(dāng)初始誘導(dǎo)時(shí)間大于24 h后，最終酶活隨初始誘導(dǎo)時(shí)間的增加而逐漸降低。當(dāng)菌體生長96 h開始誘導(dǎo)，重組菌的酶活僅為 0.03 U/mL，僅為18 h開始誘導(dǎo)酶活的0.09倍?？梢姾线m的誘導(dǎo)時(shí)間對高效全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-Cit十分重要。

圖5 誘導(dǎo)起始時(shí)間對重組菌酶活的影響

2.4.2 誘導(dǎo)時(shí)長對重組酶酶活的影響

重組菌在30 ℃培養(yǎng)18 h (600=17.2)時(shí)，補(bǔ)加IPTG至終濃度0.8 mmol/L。每隔一定時(shí)間取樣測定發(fā)酵上清液含糖量、pH值和600，開始誘導(dǎo)后每隔一定時(shí)間取菌液測定酶活。由圖6可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h即誘導(dǎo)30 h時(shí)，重組菌的酶活達(dá)0.42 U/mL，此后酶活趨于穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行120 h時(shí)酶活明顯下降。可見重組菌進(jìn)行5 L罐放大時(shí)培養(yǎng)48 h效率最高。

2.5 重組C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物濃度優(yōu)化

將重組菌在含不同濃度底物L(fēng)-Arg (0–400 g/L)條件下轉(zhuǎn)化12 h，并計(jì)算L-Cit的平均生成速率。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)L-Arg濃度小于300 g/L時(shí)，隨著底物濃度的增加，L-Cit的平均生成速率逐漸增加，至200 g/L時(shí)平均生成速率升至6.74 g/(L·h)，隨后平均生成速率緩慢增加,當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到300 g/L時(shí)平均轉(zhuǎn)化速率升至7.05 g/(L·h)。然而當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?00 g/L時(shí)由于底物抑制轉(zhuǎn)化速率快速下降，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 g/L時(shí)平均生成速率僅為3.28 g/(L·h)。因此當(dāng)L-Arg濃度為200–300 g/L時(shí)，更適合L-Cit的高效轉(zhuǎn)化。

2.6 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA的 5 L罐多批次全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

將重組菌進(jìn)行5 L罐發(fā)酵，誘導(dǎo)28 h后于37 ℃進(jìn)行罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中底物L(fēng)-精氨酸將耗盡時(shí)，離心收集細(xì)胞并用磷酸緩沖液洗滌，將細(xì)胞在上述條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化，重復(fù)多次操作。結(jié)果如圖8所示，第一批次 (0–36 h) 生產(chǎn)效率最高，轉(zhuǎn)化進(jìn)行36 h時(shí)L-Cit 濃度達(dá)299.9 g/L，平均L-Cit生成速率高達(dá)8.33 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率達(dá)99%。第三批次(72–108 h) 轉(zhuǎn)化時(shí)部分菌體開始死亡，生產(chǎn)速率逐漸下降，至第 七批次 (252–348 h) L-Cit的平均生產(chǎn)速率僅為 2.66 g/(L·h)。最終在348 h內(nèi)共投入底物L(fēng)-Arg 2 100 g/L，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成L-Cit共1 940 g/L，總平均生產(chǎn)速率為5.57 g/(L·h)，總平均轉(zhuǎn)化率為92.4%。

圖6 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA的5 L罐發(fā)酵

圖7 底物濃度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

圖8 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA 的5 L罐多批次全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

3 討論

本研究首次將來源的ADI在棒桿菌SYPA 5-5中進(jìn)行表達(dá)，并用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸。通過酶學(xué)性質(zhì)研究得知重組酶反應(yīng)的最適溫度為37 ℃，最適pH為6.5，反應(yīng)條件溫和適用于工業(yè)化放大生產(chǎn)。重組ADI與來源的ADI最適溫度相似，但重組ADI在20–50 ℃之間相對酶活優(yōu)于來源[15]。乳酸乳球菌來源的ADI具有高達(dá)60 ℃的最適溫度[16]，但此溫度既不適合微生物生長也不利于后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)和工業(yè)化。此外重組ADI在最適反應(yīng)溫度37 ℃下保溫5 h后仍有50%以上相對酶活，在高溫50 ℃下保存0.5 h仍具有37%的相對酶活。惡臭假單胞菌來源的ADI在55 ℃ (來源ADI的最適反應(yīng)溫度為50 ℃) 下保存僅3 min，酶活降低50%[17]；來源的ADI在此酶的最適反應(yīng)溫度60 ℃下保存15 min后酶活下降一半[16]，可見來源的ADI在該酶的最適溫度下有較高的熱穩(wěn)定性。

任麗梅等將單增李斯特菌來源ADI通過大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)，通過一步酶促反應(yīng)使L-精氨酸分解生成L-瓜氨酸，5.5 h內(nèi)可使94–258 g/L的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，但需添加 7 920–17 600 U/L的ADI[18]。馬越等將ACCC 10185的ADI通過大腸桿菌表達(dá)，并將此酶用于轉(zhuǎn)化L-精氨酸鹽酸鹽生成L-瓜氨酸，在最佳轉(zhuǎn)化條件下可使650 g/L L-精氨酸鹽酸鹽于7 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，但添加酶量高達(dá)24 U/g底物[19]。酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸具有反應(yīng)條件溫和、效率高等特點(diǎn)，但酶轉(zhuǎn)化法對ADI酶添加量要求較高需耗費(fèi)大量發(fā)酵原料且轉(zhuǎn)化過程中要求較高的酶穩(wěn)定性，但ADI酶普遍具有穩(wěn)定性不高的特點(diǎn)[15–17]，難以實(shí)現(xiàn)ADI酶的重復(fù)利用。本研究利用全細(xì)胞法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸，構(gòu)建重組SYPA 5-5菌株能使ADI在細(xì)胞體內(nèi)保持高效酶轉(zhuǎn)化活力，反應(yīng)條件溫和，重組菌株符合工業(yè)化安全生產(chǎn)[4]且細(xì)胞可多次利用，后續(xù)重組細(xì)胞與產(chǎn)物僅需離心便可分離，具有更好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

此前全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸文獻(xiàn)報(bào)道多集中于大腸桿菌宿主，Song等[20]將來源的ADI在BL21 (DE3)中表達(dá)，并通過易錯(cuò)PCR獲得一株高酶活突變體FMMME106，此突變體能轉(zhuǎn)化176.9 g/L的L-瓜氨酸，轉(zhuǎn)化率為92.6%；Yang等[21]使用殼聚糖固定化細(xì)胞并放大到工業(yè)化規(guī)模，210 kg的固定化細(xì)胞能轉(zhuǎn)化1 000 kg L-精氨酸生成974.6 kg L-瓜氨酸。本研究首次將ADI在棒桿菌中表達(dá)，并進(jìn)行了5 L罐發(fā)酵和罐上轉(zhuǎn)化，首批次轉(zhuǎn)化300 g/L L-精氨酸轉(zhuǎn)化速率高達(dá)8.33 g/(L·h)， 轉(zhuǎn)化率達(dá)99%，SYPA 5-5表達(dá)菌株不需固定化也能進(jìn)行多批次轉(zhuǎn)化，能大大減少發(fā)酵原料和能源的消耗，且菌株多批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸的累計(jì)產(chǎn)量的產(chǎn)量能達(dá)到1 940 g/L，總平均轉(zhuǎn)化率高達(dá)92.4%。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Production of L-citrulline by a recombinantSYPA 5-5 whole?cell biocatalyst

Qianni Liu1, Meijuan Xu1, Rongzhen Zhang1, Meizhou Wang1, Xian Zhang1, Taowei Yang1, and Zhiming Rao1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Arginine deiminase (ADI) was first high-efficient expressed inSYPA 5-5. The ADI was purified by Ni-NTA affinity chromatography and SDS-PAGE analysis showed the molecular weight (MW) was 46.8 kDa. The optimal temperature and pH of ADI were 37 ℃ and 6.5 respectively. The Michaelis constant was 12.18 mmol/L and the maximum velocity was 0.36 μmol/(min·mL). Under optimal conditions, 300 g/L of arginine was transformed and the productivity reach 8 g/(L·h). The recombinant strain was cultivated in a 5-L fermentor and used for whole-cell transformation of 300 g/L arginine, under repeated-batch bioconversion, the cumulative production reached 1 900 g/L.

arginine deiminase, L-citrulline, whole-cell conversion,

January 23, 2017;

May 17, 2017

Rongzhen Zhang. Tel: +86-510-85918201; E-mail: rzzhang @jiangnan.edu.cn Zhiming Rao. Tel: +86-510-85916881; E-mail: raozhm@jiangnan.edu.cn

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2015AA021004), National Natural Science Foundation of China (No. 31300028), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BK20150002, BK20130137).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2015AA021004)，國家自然科學(xué)基金(No. 31300028)，江蘇省自然科學(xué)基金 (Nos. BK20150002，BK20130137) 資助。