舒威，李超，劉曉云，夏建業(yè)，莊英萍

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基于葡萄糖脈沖的同位素稀釋質(zhì)譜檢測法標(biāo)品制備

舒威，李超，劉曉云，夏建業(yè)，莊英萍

華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

舒威, 李超, 劉曉云, 等. 基于葡萄糖脈沖的同位素稀釋質(zhì)譜檢測法標(biāo)品制備. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(11): 1869–1876.Shu W, Li C, Liu XY, et al. Preparation of Isotope Dilution Mass Spectrometry standards based on glucose pulse. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1869–1876.

同位素稀釋質(zhì)譜檢測法 (IDMS) 是目前進(jìn)行胞內(nèi)代謝物濃度高通量檢測精度最高的一種方法，這個方法的關(guān)鍵就是制備待檢測代謝物對應(yīng)的13C全標(biāo)記的標(biāo)品。傳統(tǒng)制備13C全標(biāo)記標(biāo)品的方法是采用批培養(yǎng)的模式獲取，但該方法所制備的胞內(nèi)代謝物濃度通常較低。通過以13C全位標(biāo)記葡萄糖作為唯一碳源培養(yǎng)畢赤酵母G/DSEL菌種，采用13C全位標(biāo)記葡萄糖脈沖刺激法，結(jié)合快速取樣淬滅方法的新方法，成功制備了帶13C標(biāo)記標(biāo)品并提高了其濃度。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS) 與氣質(zhì)聯(lián)用 (GC-MS) 結(jié)果分析，與傳統(tǒng)制備方法相比，胞內(nèi)大部分有機(jī)酸、磷酸糖、氨基酸和核苷酸類物質(zhì)的濃度實(shí)現(xiàn)了約2–10倍的提高。因此底物脈沖法可以有效提高13C全標(biāo)葡萄糖的單位利用率，并能實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)部分含量低于儀器檢測限的代謝物的檢測。

畢赤酵母G/DSEL，IDMS標(biāo)品，底物脈沖，快速取樣，液質(zhì)聯(lián)用，氣質(zhì)聯(lián)用

為高效獲取微生物代謝工程改造所需信息，需要對其代謝途徑及途徑酶的胞內(nèi) () 動力學(xué)特性有全面的了解?？梢酝ㄟ^恒化培養(yǎng)獲得處于穩(wěn)態(tài)期的細(xì)胞，利用底物脈沖結(jié)合快速取樣淬滅和胞內(nèi)代謝物提取技術(shù)，快速獲取胞內(nèi)代謝物濃度動態(tài)變化，從而獲取催化相應(yīng)代謝反應(yīng)的酶的動力學(xué)信息[1-3]。然而如何快速準(zhǔn)確測量胞內(nèi)代謝物濃度是一個難題，主要是因?yàn)橥ǔＧ闆r下胞內(nèi)代謝物濃度較低，加之提取回收過程中胞內(nèi)代謝物的稀釋也加劇了檢測的難度[4]。

在眾多的檢測方法之中，同位素稀釋質(zhì)譜檢測法 (IDMS)[4]是目前進(jìn)行胞內(nèi)代謝物濃度高通量檢測精度最高的一種方法。Wu等[5]在液質(zhì)聯(lián)用檢測基礎(chǔ)上，通過引入同位素稀釋質(zhì)譜檢測技術(shù)，以13C全標(biāo)葡萄糖培養(yǎng)的酵母細(xì)胞抽提物為內(nèi)標(biāo)，大大提高了胞內(nèi)代謝物濃度的檢測精度。該方法的關(guān)鍵就是待檢測代謝物對應(yīng)的13C標(biāo)品。由于這些標(biāo)品相對昂貴并且有些代謝物的對應(yīng)標(biāo)品甚至無商品化產(chǎn)品，因此13C胞內(nèi)中間代謝物的制備成為IDMS方法的關(guān)鍵技術(shù)之一。

畢赤酵母由于其具有生長快、培養(yǎng)基成分明確簡單的特點(diǎn)[6]，在制備IDMS標(biāo)品時被廣泛采用。傳統(tǒng)的IDMS標(biāo)品制備方法是采用批發(fā)酵的模式，在發(fā)酵結(jié)束后收集菌體進(jìn)行處理，但此時菌體處于饑餓狀態(tài)，極易造成胞內(nèi)磷酸糖類物質(zhì)被消耗，導(dǎo)致濃度過低。通過外界瞬間高濃度底物脈沖，相應(yīng)的胞內(nèi)代謝物會產(chǎn)生動態(tài)響應(yīng)[7-10]，部分胞內(nèi)代謝物濃度會出現(xiàn)短暫的升高。因此本文主要采用13C全標(biāo)記葡萄糖脈沖來制備IDMS標(biāo)品，在批發(fā)酵結(jié)束時，用一定濃度的底物脈沖，之后進(jìn)行快速取樣淬滅操作。這種方式極大地改善了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法引起的磷酸糖類物質(zhì)和能量類物質(zhì)濃度偏低的問題。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基組成：13C全標(biāo)葡萄糖20 g，K2SO418.2 g/L，CaCl20.93 g/L，KOH 4.13 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，PTM1 12.0 mL/L，85% H3PO426.8 mL/L，消泡劑1 mL/L。

PTM1組成：CuSO4·5H2O 6.0 g/L，KI 0.08 g/L，CoCl20.5 g/L，NaMoO4·2H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 3.0 g/L，H3BO30.02 g/L，ZnCl220.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0 g/L，生物素0.2 g/L，濃H2SO45 mL/g。

1.2 菌種

畢赤酵母G/DSEL為產(chǎn)β-半乳糖苷酶重組菌株，由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，構(gòu)建方法詳見文獻(xiàn)[11]報道。

2 方法

2.1 培養(yǎng)方法

本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐使用國強(qiáng)公司1 L罐，裝液量為0.6 L，接種量為1%，預(yù)先在220 r/min、30 ℃下將種子在搖瓶中培養(yǎng)24 h，取6 mL離心去除上清，加入6 mL生理鹽水復(fù)溶，接入發(fā)酵罐，采用600測菌濃。整個過程使用NaOH溶液去除通氣中CO2，通氣量為0.6 L/min (1 vvm)，批發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，脈沖刺激實(shí)驗(yàn)前期攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，為避免后期出現(xiàn)氧限制情況，在15 h左右將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)為400 r/min，控制發(fā)酵溫度為30 ℃，采用氨水控制pH在5，罐壓維持在0.05 MPa。對于整個發(fā)酵過程，使用biostar軟件進(jìn)行在線監(jiān)控，使用過程質(zhì)譜儀(MAX300-LG，Extrel) 測定尾氣中O2和CO2的濃度。

本實(shí)驗(yàn)在批發(fā)酵的基礎(chǔ)之上采用底物13C全標(biāo)記葡萄糖分批脈沖。由于培養(yǎng)體積較大，單次取樣樣品后處理時間較長，為盡量減少樣品與冷甲醇的接觸時間，防止胞內(nèi)代謝物大量泄露[12–14]，本實(shí)驗(yàn)共分4次脈沖，單次脈沖13C全標(biāo)葡萄糖濃度均為1.5 g/L。每次取樣0.15 L，分4次取完。當(dāng)溶氧DO開始回升OUR開始下降時進(jìn)行13C全標(biāo)記葡萄糖脈沖，5 min后開始快速取樣操作。在OUR、CER再次下降時，進(jìn)行第二次底物脈沖，后續(xù)脈沖重復(fù)該步驟。未進(jìn)行底物脈沖實(shí)驗(yàn)的底物濃度等于進(jìn)行底物脈沖刺激實(shí)驗(yàn)底物的濃度與脈沖所用底物之和，其余條件一致。

2.2 快速取樣

胞內(nèi)代謝物濃度一般很低，而對應(yīng)的酶反應(yīng)速度較快，因此需對取樣的細(xì)胞進(jìn)行快速淬 滅[15-17]。快速取樣淬滅方法在文獻(xiàn)報道[18-20]的基礎(chǔ)上略微做了改進(jìn)，具體如下：快速取出150 mL發(fā)酵液到750 mL –80 ℃的60%冷甲醇溶液中，并記錄取樣前后冷甲醇溶液質(zhì)量。然后均勻分裝至樣品管，每個樣品管裝液量45 mL，置于–20 ℃離心機(jī)4 000 r/min離心5 min。

2.3 沸乙醇提取胞內(nèi)代謝物

將離心好的樣品去除上清，迅速加入到30 mL 75 ℃的75%乙醇溶液，漩渦振蕩混勻，置于95 ℃水浴4 min。后冷卻，低溫離心收集上清。

2.4 濃縮分裝

將離心后收集的上清液分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL后，混合定容至80 mL，然后分裝至530個1.5 mL EP管中，每管裝液量為150 μL,置于–80 ℃冰箱內(nèi)保存，同時取部分制備的標(biāo)品進(jìn)樣LC-MS/MS和GC-MS檢測分析結(jié)果。

2.5 質(zhì)譜分析方法

2.5.1 LC-MS分析

測定胞內(nèi)有機(jī)酸、磷酸糖和核苷酸類采用LC-MS/MS (Thermal Ultimate 3000 UPLC+ Thermal TSQ QUANTUM ULTRA) 分析，使用文獻(xiàn)報道的分析方法[21-22]并稍作修改。所用數(shù)據(jù)處理軟件為Xcalibur (Thermo Scientific)。質(zhì)譜采用負(fù)離子SRM (Selected Reaction Monitoring) 模式。用直接進(jìn)樣法獲取待測物的離子對和最優(yōu)質(zhì)譜條件，其中毛細(xì)管溫度為270 ℃，霧化溫度 200 ℃，鞘氣壓力15 Arb，輔助氣壓力10 Arb，噴霧電壓3 000 V。色譜部分：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×150 mm，柱溫25 ℃，流動相A為5%乙腈加5 mmol/L DBAA (二丁胺乙酸)，流動相B為84%乙腈加5 mmol/L DBAA。洗脫梯度如下：0 min時B的比例為0%；0?20 min時，流動相B的比例從0%上升到20%維持2 min后再降到0%并維持10 min。流動相流速為0.2 mL/min。

2.5.2 GC-MS分析

胞內(nèi)氨基酸的測定采用GC-MS，分析方法在文獻(xiàn)[23]基礎(chǔ)上稍作修改。具體如下：取100 μL處理好的樣品到氣相小瓶中并加入30 μL 100 mg/mL NaCl 放入–80 ℃冰箱30 min后冷凍抽干過夜。加入100 μL 乙腈和100 μL衍生劑N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺+1%叔丁基二甲基氯硅烷 (MTBSTFA:TBDMSCL=99:1) 70 ℃維持60 min。冷卻至室溫后，離心取上清進(jìn)樣。使用的儀器是7890A GC (Agilent，Santa Clara，CA，USA) 串聯(lián)5975C MSD 單級質(zhì)譜 (Agilent，Santa Clara，CA，USA)。測定條件如下：進(jìn)樣量1 μL；使用的柱子：HP-5MS 30 m× 0.25 mm×0.25 μm (5% phenyl methyl siloxane)非極性彈性石英毛細(xì)管柱，升溫程序：100 ℃維持1 min 后以10 ℃/min 的速度升溫到300 ℃并維持10 min。載氣高純氦流速1 mL/min。傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃。EI源電壓70 eV。為了準(zhǔn)確定量采取SIM (Selected ion monitoring，SIM) 模式，質(zhì)譜掃描范圍為1–1 050 amu。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)酵過程宏觀數(shù)據(jù)分析

圖1是未進(jìn)行底物脈沖刺激實(shí)驗(yàn)和進(jìn)行底物脈沖刺激實(shí)驗(yàn)的整個發(fā)酵過程DO的變化曲線，圖中1、2、3、4分別代表4次底物脈沖，5處表示攪拌轉(zhuǎn)速提高。為避免在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)氧限制情況，故將攪拌轉(zhuǎn)速從300 r/min提至400 r/min，此時DO上升。結(jié)合圖2，CER和OUR在此時并未出現(xiàn)下降，因此DO的上升與菌體的生理狀態(tài)無關(guān)。脈沖實(shí)驗(yàn)在18 h左右開始。此時DO開始回升，發(fā)酵罐內(nèi)13C全標(biāo)記葡萄糖基本耗盡。第一次底物脈沖，DO快速下降，約5 min后開始快速取樣。待DO再次回升后進(jìn)行第二次脈沖，依次類推，共進(jìn)行4次脈沖。

圖2是未進(jìn)行底物脈沖刺激實(shí)驗(yàn)和進(jìn)行底物脈沖刺激實(shí)驗(yàn)的整個發(fā)酵過程CER和OUR的變化曲線。從圖中可以看出兩批實(shí)驗(yàn)平行性良好，整個培養(yǎng)過程約為20 h，經(jīng)過約10 h的延滯期后，CER和OUR開始快速增加。因進(jìn)行底物脈沖的實(shí)驗(yàn)初始菌濃略低于未進(jìn)行底物脈沖的實(shí)驗(yàn) (初糖濃度分別為16.25 g/L和20 g/L)，所以CER和OUR下降的時間略早于未進(jìn)行底物脈沖的實(shí)驗(yàn)。通過600測出兩批發(fā)酵液菌濃約為25 g/L。

3.2 胞內(nèi)代謝物濃度分析

3.2.1 胞內(nèi)有機(jī)酸

圖3是測定得到的未進(jìn)行底物脈沖和進(jìn)行底物脈沖實(shí)驗(yàn)的胞內(nèi)有機(jī)酸濃度對比情況。經(jīng)過底物脈沖刺激后，胞內(nèi)有機(jī)酸含量大幅提高，尤其是蘋果酸提高約18倍，其余有機(jī)酸均有2–10倍 的提高。與傳統(tǒng)未底物脈沖方法相比，在糖耗盡后進(jìn)行底物脈沖，瞬間提高的底物濃度被細(xì)胞攝取，引起胞內(nèi)代謝物含量迅速增加，在糖未耗盡前快速取樣淬滅，細(xì)胞胞內(nèi)代謝物濃度仍維持在較高水平。而傳統(tǒng)方法是在發(fā)酵結(jié)束糖耗盡之后進(jìn)行取樣，因此造成胞內(nèi)代謝物濃度較低。

圖1 畢赤酵母發(fā)酵過程DO隨時間變化關(guān)系

圖2 未底物脈沖與底物脈沖畢赤酵母發(fā)酵過程CER和OUR隨時間變化情況

3.2.2 胞內(nèi)磷酸糖

圖4是測得的未進(jìn)行底物脈沖和進(jìn)行底物脈沖的胞內(nèi)磷酸糖類物質(zhì)濃度對比。其中赤蘚 糖-4-磷酸提高幅度最大，約10倍左右，其他的物質(zhì)也有不同程度的提高。13C全標(biāo)記葡萄糖被細(xì)胞攝取之后，首先經(jīng)EMP途徑和PP途徑，傳統(tǒng)方法在糖耗盡后取樣制備的標(biāo)品中磷酸糖類物質(zhì)優(yōu)先被代謝，因此濃度較低，而在底物脈沖之后可使其維持濃度在較高水平。

3.2.3 胞內(nèi)氨基酸

圖5為測得的未進(jìn)行底物脈沖和進(jìn)行底物脈沖的胞內(nèi)氨基酸含量對比情況。從圖中可以看出，除天冬氨酸與組氨酸外，胞內(nèi)大部分氨基酸含量在底物脈沖后都有大幅度提高，尤其脯氨酸和甘氨酸，均提高了約15倍。其余氨基酸含量均有2–5倍的提高。因?yàn)榘麅?nèi)氨基酸代謝偶聯(lián)胞內(nèi)中心碳代謝的部分代謝物，因此胞內(nèi)磷酸糖類物質(zhì)和有機(jī)酸類物質(zhì)濃度的提高引起相應(yīng)氨基酸濃度的增加。

圖3 底物脈沖與未底物脈沖胞內(nèi)有機(jī)酸含量對比

圖4 底物脈沖與未底物脈沖胞內(nèi)磷酸糖含量對比

3.2.4 胞內(nèi)核苷酸

圖6為測得的未進(jìn)行底物脈沖和進(jìn)行底物脈沖之后胞內(nèi)核苷酸類物質(zhì)濃度的對比情況。經(jīng)底物脈沖后，胞內(nèi)ATP、ADP、NADH和NAD的含量都大大提高，但AMP的濃度相對于未脈沖的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了下降，其具體原因尚不清楚。

圖5 底物脈沖與未底物脈沖胞內(nèi)氨基酸含量對比

圖6 底物脈沖與未底物脈沖胞內(nèi)核苷酸類物質(zhì)含量對比

3.3 結(jié)果討論

通過以上結(jié)果的分析可見，經(jīng)底物脈沖刺激后，胞內(nèi)中心碳代謝途徑的大部分代謝物濃度均有提高，與文獻(xiàn)結(jié)果類似[24-25]。其原因分析為胞外葡萄糖濃度瞬間提高之后，細(xì)胞攝取的葡萄糖量迅速增加，經(jīng)EMP途徑，6-磷酸-葡萄酸、果糖-1,6-二磷酸、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、丙酮酸等代謝物濃度均有大幅提高；與此同時由于ATP的含量大大提高，為各種合成反應(yīng)也提供了所需的能量。伴隨著3-磷酸甘油酸和丙酮酸濃度的增加，分別與之偶聯(lián)的絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和纈氨酸含量也大幅提高。由于胞內(nèi)6-磷酸葡糖酸濃度的增加，因此PP途徑的部分代謝物濃度也隨之增加，其中核酮糖-5-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸濃度提升幅度較大，而核糖-5-磷酸濃度提升較小，因此以其為前體的組氨酸含量也僅有略微增加。最后，由于丙酮酸的濃度提高了2.5倍左右，因此TCA循環(huán)的代謝物濃度也隨之增加，其中檸檬酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸和蘋果酸的濃度提高幅度較大，因此以蘋果酸為前體的天冬氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸濃度也相應(yīng)提高，以α-酮戊二酸為前體的脯氨酸濃度得到極大的提高。

雖然經(jīng)底物脈沖刺激之后，胞內(nèi)中心碳代謝的大部分代謝物濃度都得到提高，但是也有部分代謝物的濃度出現(xiàn)了下降。圖7為測得的未進(jìn)行底物脈沖和進(jìn)行底物脈沖后出現(xiàn)濃度下降的代謝物的對比情況。出現(xiàn)代謝物濃度下降的原因目前尚不清楚，分析可能是由于ATP含量大大提高，胞內(nèi)某些處于抑制狀態(tài)的合成途徑被激活，造成作為前體的部分代謝物濃度迅速降低。對于部分代謝物濃度下降的真正原因需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將作為本課題下一步研究的內(nèi)容。

圖7 經(jīng)底物脈沖后胞內(nèi)濃度降低的代謝物

4 結(jié)論

本文主要采用了13C全標(biāo)記葡萄糖作為唯一碳源培養(yǎng)畢赤酵母G/DSEL，基于葡萄糖脈沖并結(jié)合快速取樣淬滅技術(shù)制備13C標(biāo)品。同時與傳統(tǒng)未采用底物脈沖的批發(fā)酵模式進(jìn)行了對比，通過LC-MS/MS與GC-MS的結(jié)果分析，主要比較了兩種方法制備的標(biāo)品濃度差異。

綜上所述，進(jìn)行底物脈沖制備IDMS13C標(biāo)品可大幅提高標(biāo)品的濃度，其快速取樣點(diǎn)處于糖未完全耗盡時，因此胞內(nèi)中心碳代謝大部分代謝物濃度均有大幅度的提高。因此，基于底物脈沖制備IDMS13C標(biāo)品能極大改善傳統(tǒng)批培養(yǎng)制備標(biāo)品濃度較低的問題，同時也能節(jié)約成本，提高標(biāo)品的利用率。此外，底物脈沖法對實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)部分含量低于當(dāng)前儀器檢測限的代謝物的檢測具有重要的參考意義。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Preparation of isotope dilution mass spectrometry standards based on glucose pulse

Wei Shu, Chao Li, Xiaoyun Liu, Jianye Xia, and Yingping Zhuang

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Isotope Dilution Mass Spectrometry (IDMS) is the most accurate method for high-throughput detection of intracellular metabolite concentrations, and the key is getting the corresponding fully uniformly(U)13C-labeled metabolites to be measured. The conventional procedure for getting fully U13C-labeled metabolites is through batch cultivation, but intracellular metabolites concentrations by this method are generally low. By applying U13C-labeled glucose pulse, combined with fast sampling and quenching, mixture of fully U13C-labeled intracellular metabolites was successfully extracted with higher concentration fromG/DSEL fed with fully U13C-labeled glucose as only carbon source. Quantitative results from liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS) and gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS) show that concentrations of organic acids, sugar phosphates, amino acids and nucleotides were 2–10 folds higher than those without glucose pulse. Therefore, the glucose pulse method can efficiently improve the usage of fully U13C-labeled glucose converting to13C-labeled metabolites, and achieve the detection of intracellular metabolites with lower concentrate than the instrument detection limit.

G/DSEL, IDMS standard, substrates pulse, fast sampling, LC-MS, GC-MS

February 16, 2017;

April 19, 2017

Jianye Xia. Tel: +86-21-64251946; E-mail: jyxia@ecust.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation for Young Scholars of China (No. 21506052 ), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 222201414037).

國家自然科學(xué)基金青年基金 (No. 21506052)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金 (No. 222201414037) 資助。

2017-05-03

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