姜言暉，張京良，江曉路,3,4

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球形節(jié)桿菌A152產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)模型的建立

姜言暉1，張京良2,3，江曉路1,3,4

1 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003 2 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東青島 266003 3 青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266071 4 青島明月海藻集團(tuán)有限公司，海藻活性物質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400

姜言暉, 張京良, 江曉路.球形節(jié)桿菌A152產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)模型的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(11): 1883–1888.Jiang YH, Zhang JL, Jiang XL. Establishment of kinetics digital model for hyaluronate lyase productionbased on fermentation optimization of Arthrobacter globiformis A152. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1883–1888.

以制備高產(chǎn)量的透明質(zhì)酸酶為出發(fā)點(diǎn)，利用5 L發(fā)酵罐對(duì)球形節(jié)桿菌A152發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速400 r/min、通氣量3.5 L/min時(shí)，生物量和透明質(zhì)酸酶酶活力最優(yōu)，分別為5 g/L、16.4 U/mL；同時(shí)對(duì)發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物生成及基質(zhì)消耗的規(guī)律進(jìn)行研究，應(yīng)用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和底物消耗的物料平衡方程建立了球形節(jié)桿菌A152發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)模型，并通過MATLAB軟件進(jìn)行最優(yōu)參數(shù)估計(jì)和非線性擬合。模型的計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值能較好地?cái)M合，表明所建的模型能較好地反映發(fā)酵過程，可為發(fā)酵過程的在線控制和預(yù)測提供理論基礎(chǔ)。

透明質(zhì)酸酶，發(fā)酵優(yōu)化，動(dòng)力學(xué)模型，非線性擬合

透明質(zhì)酸酶 (Hyaluronidase，HAase) 是能夠使透明質(zhì)酸產(chǎn)生低分子化作用酶的總稱。根據(jù)作用機(jī)制不同，分為哺乳動(dòng)物及動(dòng)物毒液來源的內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，水蛭、十二指腸蟲來源的內(nèi)切-β-葡糖苷酸酶及細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸酶3類[1]。

透明質(zhì)酸酶可改善藥物的組織滲透性，促進(jìn)藥物擴(kuò)散和吸收[2]，它降解生成的低分子透明質(zhì)酸寡糖具有促進(jìn)骨和血管的生成[3]、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[4]、抗腫瘤[5]及抗炎[6]等功效，在醫(yī)藥方面具有良好的應(yīng)用前景。現(xiàn)階段，透明質(zhì)酸酶多從動(dòng)物睪丸組織提取[7]，由于原料有限、含量低等原因限制了它的開發(fā)應(yīng)用，而微生物來源的透明質(zhì)酸酶可避免這些缺陷。目前微生物來源的透明質(zhì)酸酶的研究主要集中在菌株的選育方面[8]，對(duì)產(chǎn)酶菌株發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面的研究未見報(bào)道。

發(fā)酵罐發(fā)酵是實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵的放大，為工業(yè)化放大提供依據(jù)，有利于實(shí)現(xiàn)成果從實(shí)驗(yàn)室水平向工業(yè)化水平的轉(zhuǎn)變。通過前期研究發(fā)現(xiàn)球形節(jié)桿菌A152發(fā)酵生產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶具有良好的溫度和pH穩(wěn)定性，在醫(yī)藥和生物化工方面具有良好應(yīng)用價(jià)值。本文在搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，利用5 L發(fā)酵罐對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)通氣量、轉(zhuǎn)速及補(bǔ)料的研究，確定最適的發(fā)酵條件及控制參數(shù)。在發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立A152生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的動(dòng)力學(xué)模型，探索發(fā)酵過程變化規(guī)律，為發(fā)酵過程的預(yù)測和控制提供理論方程，為其在線控制和自動(dòng)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

球形節(jié)桿菌A152，由食品科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

種子培養(yǎng)基：K2HPO41 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、CaCl20.01 g/L、牛肉膏5 g/L、蛋白胨1 g/L、HA 0.5 g/L，pH調(diào)至7.0，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO41.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、CaCl20.01 g/L、牛肉膏5 g/L、蛋白胨1 g/L、HA 4 g/L，pH調(diào)至7.0，115 ℃滅菌30 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：K2HPO41.5 g/L、MgSO40.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、CaCl20.01 g/L、牛肉膏25 g/L、蛋白胨5 g/L、HA 20 g/L，pH調(diào)至7.0，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BLBIO-5GJ-4-H 5L四聯(lián)自動(dòng)發(fā)酵罐，上海百倫生物科技有限公司；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-6000PC紫外型可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)方法

取一環(huán)菌接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，160 r /min、28 ℃培養(yǎng)24 h，得一級(jí)種子培養(yǎng)液。將一級(jí)種子培養(yǎng)液以5%的接種量接入裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，同種方式培養(yǎng)獲得二級(jí)種子液。將二級(jí)種子液以5%的接種量接種至裝有3.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，控制適宜的轉(zhuǎn)速和通氣量，于24 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

控制其他條件相同，分別考察轉(zhuǎn)速 (200、400、600、800 r /min)、通氣量 (1.75、3.50、4.75 L/min)、補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵體系的溶氧量 (DO)、透明質(zhì)酸酶的產(chǎn)量和生物量的影響，篩選適宜的轉(zhuǎn)速、通氣量及補(bǔ)料條件。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定

在發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，以660 nm的吸光值 (660) 表征生物量[9]；在動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn)中，以菌體干重表示生物量[10]。

菌體干重 ()：取10 mL發(fā)酵液于預(yù)先稱重的離心管 (0) 中，8 000 r/min離心10 min，棄上清，加入10 mL蒸餾水離心洗滌2次，棄上清，沉淀于80 ℃烘箱烘干至恒重 (n)。

=n–0

1.4.2 酶活力的測定

酶活力單位定義[11]：37 ℃條件下，每分鐘催化形成1 μmol不飽和雙糖消耗的酶量。酶活力的測定：取20 μL經(jīng)6 000 r/min離心10 min的發(fā)酵上清液、3.98 mL 0.02 mol/L Tris-HCL (pH 7.5) 和4 mL 0.2%透明質(zhì)酸 (0.02 mol/L Tris-HCL配制，pH 7.5) 加入15 mL的比色管中，37 ℃水浴反應(yīng)20 min后，置于沸水浴中煮沸5 min，對(duì)照管以相同的條件加入滅活的發(fā)酵上清液，測定232 nm處光吸收值。

式中，指232 nm處的吸光值；?指毫摩爾消光系數(shù)，取5.5；d指比色皿的厚度，1 cm；指反應(yīng)的時(shí)間 (min)；t指反應(yīng)的總體積 (mL)；s指樣品的體積 (mL)。

1.4.3 殘?zhí)橇康臏y定

采用DNS法[12]測定發(fā)酵液中的殘?zhí)恰?/p>

1.4.4 溶氧量的測定

采用溶氧電極測定發(fā)酵液中的溶氧量。

1.5 動(dòng)力學(xué)模型

1.5.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型的建立

利用Logistic方程[9]建立A152的菌體生長動(dòng)力學(xué)模型，描述菌體生長速率的Logistic微分方程為

式中，d/d為菌體的生長速率 (g/(L·h))；為菌體濃度 (g/L)；為發(fā)酵時(shí)間 (h)；為比生長速率 (h–1)；max為最大比生長速率 (h–1)；max為最大菌體濃度 (g/L)。

初始條件=0時(shí)，得=0，積分式為

1.5.2 產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型的建立

采用Luedeking-Piret方程[9]建立A152的產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型，描述透明質(zhì)酸酶合成速率的Luedeking-Piret微分方程為

式中，d/d為產(chǎn)物合成速率 (g/(L·h))；為產(chǎn)物的濃度 (g/L)；為與菌體生長速率有關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù) (g/(L·h))，為與菌體濃度關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成濃度 (g/(L·h))?！?、=0時(shí)，產(chǎn)物合成與菌體生長相偶聯(lián)；≠0、≠0時(shí)，產(chǎn)物合成與菌體生長部分偶聯(lián)；=0、≠0時(shí)，產(chǎn)物合成與菌體生長非偶聯(lián)。

初始條件=0時(shí)，得=0，積分式為

1.5.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立

在發(fā)酵過程中，底物消耗主要用于菌體的生長、產(chǎn)物合成及細(xì)胞代謝的維持。根據(jù)基質(zhì)平衡原理，建立底物消耗的物料平衡微分方程[9]為

式中，–/為底物消耗速率(g/(L·h))，為底物濃度(g/L)，x/s為菌體對(duì)底物的得率(g/g)，p/s為產(chǎn)物對(duì)底物的得率(g/g)，m為菌體的維持因子(h–1)。

初始條件=0時(shí)，得=0，積分式為

1.5.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用EXCEL 2010及MATLAB R2012a進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析與模型擬合分析。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 轉(zhuǎn)速對(duì)透明質(zhì)酸酶發(fā)酵的影響

微生物發(fā)酵過程培養(yǎng)基組分的均勻和溶氧都與攪拌相關(guān)。由圖1可知，200 r/min時(shí)，溶氧始終保持極低的水平，溶氧不足導(dǎo)致菌體生長緩慢，透明質(zhì)酸酶的合成延滯，發(fā)酵周期延長。而在400 r/min時(shí)， 18 h達(dá)到產(chǎn)酶最高點(diǎn)，為8.68?U/mL，轉(zhuǎn)速600 r/min與400 r/min的規(guī)律一致，在18?h達(dá)到產(chǎn)酶最高點(diǎn)，為8.66 U/mL，二者酶產(chǎn)量相差不大，而在800 r/min時(shí)，在14 h即可達(dá)到產(chǎn)酶最高點(diǎn)，酶產(chǎn)量較400 r/min和600 r/min低，為8.02 U/mL。綜上，選擇400 r/min作為發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的最適轉(zhuǎn)速。

圖1 轉(zhuǎn)速對(duì)Arthrobacter globiformis A152產(chǎn)透明質(zhì)酸酶發(fā)酵過程的影響(A：DO、OD660；B：酶活力)

2.1.2 通氣量對(duì)透明質(zhì)酸酶發(fā)酵的影響

通氣量可以改變培養(yǎng)基中菌體細(xì)胞之間的氧傳遞系數(shù)而間接影響菌體對(duì)培養(yǎng)基組分的利用效率，適當(dāng)?shù)耐饬坑欣诰w細(xì)胞內(nèi)外養(yǎng)分平衡、菌體濃度的積累以及目的產(chǎn)物的釋放[13]。由圖2可以看出，通氣量越大，溶氧低水平期越短，通氣量1.75 L/min時(shí)，生物量總體偏低，產(chǎn)酶最高點(diǎn)也略微延遲；通氣量為3.50 L/min時(shí)，酶產(chǎn)量在18?h達(dá)到最大，為8.16 U/mL，通氣量為4.75 L/min時(shí)，酶產(chǎn)量相對(duì)較低，為7.98 U/mL。通氣量低影響菌體生長，生物量和酶產(chǎn)量偏低；通氣量過高，培養(yǎng)基中的氧氣處于過飽和狀態(tài)，菌體代謝異常，酶產(chǎn)量略有下降。與通氣量為1.75 L/min相比，通氣量3.50 L/min和4.75 L/min生物量和酶活力均有提高，說明氧氣供應(yīng)充足，可以充分滿足菌體生長，但通氣過量，會(huì)抑制菌體產(chǎn)酶。從節(jié)省能源和酶產(chǎn)量兩方面考慮，選擇3.50 L/min作為發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的最適通氣量。

2.1.3 補(bǔ)料對(duì)透明質(zhì)酸酶發(fā)酵的影響

根據(jù)菌體的生長和初始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在發(fā)酵的某些階段進(jìn)行補(bǔ)加培養(yǎng)基，使菌體或其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間延長，使產(chǎn)物生成增加[14]。由圖3可知，發(fā)酵前期，菌體生長迅速，底物消耗增加，殘?zhí)橇繙p少，在12?h最低，限制菌體的生長。因此，選擇在12 h補(bǔ)料600 mL。與未補(bǔ)料相比，補(bǔ)料后殘?zhí)橇吭黾樱瑸榫w生長提供充足的營養(yǎng)，生物量增加，但酶活力卻有所降低，不利于產(chǎn)酶，后續(xù)發(fā)酵選擇不補(bǔ)料。

圖2 通氣量對(duì)Arthrobacter globiformis A152產(chǎn)透明質(zhì)酸酶發(fā)酵過程的影響(A：DO、OD660；B：酶活力)

2.2 Arthrobacter globiformis A152生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵過程曲線及分析

A152產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵過程曲線如圖4所示，殘?zhí)橇肯染徛陆岛罂焖傧陆底詈筅呌谄椒€(wěn)，在發(fā)酵4 h內(nèi)緩慢下降，4–12 h迅速下降，12 h之后維持在0.5 mg/mL以下，保持穩(wěn)定。生物量與其變化趨勢相反，12 h后穩(wěn)定在5 g/L，生物量與殘?zhí)橇康淖兓竭M(jìn)行。產(chǎn)酶量的變化略有不同，0–6 h緩慢增加，6–18 h迅速升高，在18 h后維持在16.4 U/mL左右，達(dá)到最高。以上數(shù)據(jù)表明，發(fā)酵過程中菌體生長消耗底物，使基質(zhì)中的殘?zhí)橇砍掷m(xù)降低，生物量逐漸增加，透明質(zhì)酸酶酶活力逐漸升高，當(dāng)殘?zhí)橇吭?.5 mg/mL以下時(shí)，不足以維持菌體的生長，此時(shí)生物量達(dá)到最大，pH降至最低，產(chǎn)酶量繼續(xù)增加，在4?h后達(dá)到產(chǎn)酶最高點(diǎn)。pH在整個(gè)發(fā)酵的過程中呈先降低后升高的趨勢，表明菌體在合成透明質(zhì)酸酶的過程中產(chǎn)酸，在12 h生物量達(dá)到最大，此時(shí)pH和殘?zhí)橇烤陆抵磷畹忘c(diǎn)，12 h后pH逐漸升高然后趨于穩(wěn)定，pH的變化可能是由于殘?zhí)橇坎蛔阋鸬?。酶產(chǎn)量在pH降至最低點(diǎn)后6?h達(dá)到最高點(diǎn)，可通過pH的變化對(duì)整個(gè)發(fā)酵終點(diǎn)進(jìn)行控制，以獲得高產(chǎn)量的透明質(zhì)酸酶。

圖3 補(bǔ)料對(duì)Arthrobacter globiformis A152生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶發(fā)酵過程的影響

圖4 Arthrobacter globiformis A152生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵曲線

2.3 模型參數(shù)求解及數(shù)據(jù)擬合

采用MATLAB軟件對(duì)球形節(jié)桿菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程 (2)、(4)、(6) 進(jìn)行非線性擬合，得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。

將模型參數(shù)值代入 (2)、(4)、(6) 式，得到菌體生長、產(chǎn)物合成和底物消耗動(dòng)力學(xué)方程分別為：

2.4 擬合曲線分析

A152發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示，從圖中可以看出，擬合值與實(shí)驗(yàn)值較為接近，曲線擬合度2分別為0.983 8、0.973 6和0.921 2，表明模型的擬合效果良好，能夠較好地反映實(shí)際的發(fā)酵過程。

表1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)值

3 討論

發(fā)酵工程的理論和方法已廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物產(chǎn)品的生產(chǎn)及工藝優(yōu)化，使現(xiàn)代工業(yè)微生物發(fā)酵取得了高速發(fā)展[15]。本文利用5?L發(fā)酵罐生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶，通過優(yōu)化其培養(yǎng)條件，得到穩(wěn)定的發(fā)酵工藝，在轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為3.5 L/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)18 h，其產(chǎn)酶高達(dá)16.4 U/mL，與搖瓶 (發(fā)酵周期為24 h，酶產(chǎn)量為12.8 U/mL) 相比，發(fā)酵周期縮短了25%，酶產(chǎn)量提高了28%。且通過濁度法測得透明質(zhì)酸酶酶活力達(dá)1.36×104U/mL，遠(yuǎn)高于報(bào)道的輕型鏈球菌MTCC 2695[16]和噬尼古丁節(jié)桿菌[17]產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶的酶活力，且本文的發(fā)酵周期縮短，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。此外，本研究的菌株易于培養(yǎng)，營養(yǎng)要求簡單，可規(guī)?；瘧?yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)酵動(dòng)力對(duì)發(fā)酵工藝的分析、優(yōu)化、放大和控制具有重要的指導(dǎo)意義。王瑩等[18]對(duì)羊肚菌液體深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，對(duì)菌體生長、多糖產(chǎn)生和基質(zhì)消耗模型進(jìn)行了參數(shù)估計(jì)。本文對(duì)A152發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，通過建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗的變化規(guī)律。模型擬合結(jié)果表明，三條曲線的擬合度分別為0.983 8、0.973 6和0.921 2，擬合值與實(shí)驗(yàn)值相近，模型能較好地反映發(fā)酵過程規(guī)律，對(duì)A152發(fā)酵過程的在線控制及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義?？紤]到實(shí)驗(yàn)過程中不能進(jìn)行全程自動(dòng)化控制，人工抽樣檢測可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來一定影響，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行深入研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Establishment of kinetics digital model for hyaluronate lyase productionbased on fermentation optimization ofA152

Yanhui Jiang1, Jingliang Zhang2,3, and Xiaolu Jiang1,3,4

1 College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong, China2 College of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong, China3 Marine Biomedical Research Institute of Qingdao, Qingdao 266071, Shandong, China4 State Key Laboratory of Bioactive Seaweed Substances, Qingdao Brightmoon Seaweed Group Co. Ltd, Qingdao 266400, Shandong, China

In order to produce hyaluronate lyase of high yield, we optimized the fermentationA152 in quadruple fermentation of 5 L, and studied the kinetics of fermentation. Both the highest biomass and enzyme activity could be achieved when the rotation speed was 400 r/min and the ventilation volume was 3.5 L/min. In addition, digital models of cell growth, product synthesis and substrate consumption were built by equation of logistic, luedeking-piret, product synthesis and substrate consumption. Nonlinear fitting and estimation of optimal parameters were obtained by MATLAB. The model correlated well between prediction and experimental data, and reflected the change rules of cell growth, hyaluronidase synthesis and substrate consumption during the process of producing hyaluronate lyase. The establishment of fermentation kinetics digital models could provide basis for controlling and prediction of the production process.

hyaluronate lyase, fermentation optimization, kinetics model, nonlinear fitting

December 13, 2016;

June 8, 2017

Xiaolu Jiang. Tel: +86-532-82032290; E-mail: jiangxl@ouc.edu.cn

Supported by:Scientific and Technological Project in Shandong Province (No. 2015GSF115002).

山東省科技廳 (No. 2015GSF115002) 資助。

2017-09-15

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170915.1039.001.html