嚴(yán)麗蔚，鞏蔚，朱文兵，張雪梅，徐婧雯，吳忠香，盧孔杰，孫明，董少忠

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狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)及純化及其記憶性B細(xì)胞結(jié)合能力的分析

嚴(yán)麗蔚，鞏蔚，朱文兵，張雪梅，徐婧雯，吳忠香，盧孔杰，孫明，董少忠

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650118

嚴(yán)麗蔚, 鞏蔚, 朱文兵,等. 狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)及純化及其記憶性B細(xì)胞結(jié)合能力的分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(11): 1840–1849.Yan LW, Gong W, Zhu WB, et al. Expression and purification of rabies virus glycoprotein and analysis of its specific binding capacity to memory B cells. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1840–1849.

表達(dá)純化不同標(biāo)簽、不同大小3個(gè)狂犬病病毒糖蛋白，分析其結(jié)合功能后，得到具備高親和力的、可特異性結(jié)合記憶性B細(xì)胞的狂犬病病毒糖蛋白。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因工程的方法，采用不同的原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)帶有不同標(biāo)簽的、全長(zhǎng)和膜外區(qū)的RVG，純化蛋白并分析比較其結(jié)合功能，熒光標(biāo)記候選蛋白，結(jié)合CD19及CD27的抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特異性記憶性B細(xì)胞的情況，確認(rèn)候選蛋白與抗狂犬病毒特異性記憶性B細(xì)胞的結(jié)合功能。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了3個(gè)表達(dá)載體pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G，優(yōu)化表達(dá)純化條件成功獲得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。純化后的GST-RVG、His-RVG和His-G經(jīng)Western blotting和ELISA鑒定均有抗原特異性；由競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)得3個(gè)純化后糖蛋白與抗狂犬病病毒抗體的親和力。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)到狂犬疫苗免疫后陽(yáng)性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特異性記憶性B細(xì)胞，從而獲得了高親和力、可用于分選抗原特異性的記憶性B細(xì)胞的狂犬病病毒糖蛋白。

狂犬病病毒糖蛋白，抗原特異性記憶性B細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)

狂犬病病毒糖蛋白(RVG)是一種典型的跨膜糖蛋白，作為唯一暴露在病毒顆粒表面并誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原[1]，其介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面受體的結(jié)合[2-3]，與病毒毒力直接相關(guān)，是有效的保護(hù)性抗原[4]。目前，主要運(yùn)用不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)基因全長(zhǎng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母[5-6]和昆蟲(chóng)細(xì)胞[7-8]等。但大多數(shù)情況下表達(dá)產(chǎn)量較低且純度不高，不利于后續(xù)的研究應(yīng)用[9]。鑒于狂犬病毒糖蛋白膜外區(qū)是決定抗原性、組織嗜性及毒力的最重要部分，RVG上第Ⅱ和第Ⅲ抗原部位是病毒與中和抗體的主要結(jié)合部位[10]，因此，也有研究嘗試采用截?cái)嗟幕蚱芜M(jìn)行表達(dá)和純化[11]。

抗體是由漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生，記憶性B細(xì)胞在機(jī)體再次感染同一抗原時(shí)，可以快速分化為分泌抗體的漿細(xì)胞，介導(dǎo)迅速的記憶性免疫應(yīng)答[12]，故對(duì)特異性記憶性B細(xì)胞進(jìn)行分析，也是對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫評(píng)價(jià)的一個(gè)重要補(bǔ)充。同時(shí)，單個(gè)B細(xì)胞分選單抗技術(shù)要求具備高親和力結(jié)合記憶B細(xì)胞特異性抗原[13]。單個(gè)特異性記憶性B細(xì)胞分選制備單克隆抗體是一種制備單克隆抗體的新型方法[14]。此方法的關(guān)鍵點(diǎn)是利用流式技術(shù)獲得單個(gè)特異性記憶性B細(xì)胞，候選抗原的純度、濃度以及和抗體的親和力等對(duì)分選至關(guān)重要[15]。鑒于狂犬病病毒的糖蛋白與感染、免疫和抗體水平評(píng)價(jià)、抗體分選的緊密關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同表達(dá)系統(tǒng)獲得不同的目的蛋白，以期能夠獲取用于分選特異性記憶B細(xì)胞的候選抗原。

本實(shí)驗(yàn)采用基因工程的方法，利用不同的原核表達(dá)系統(tǒng) (pGEX-5X-1，pET28a，pET30a) 分別表達(dá)帶有不同標(biāo)簽 (GST-tag和His-tag)的全長(zhǎng)和膜外區(qū)RVG，純化后鑒定、分析比較和狂犬免疫球蛋白的結(jié)合能力，再利用熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞技術(shù)，用于目標(biāo)記憶B細(xì)胞的分選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和Rosetta (DE3)pLysS以及原核表達(dá)載體pGEX-5X-1(4972bp，GST-tag)、pET28a(5 369 bp，His-tag)、pET30a(5422 bp，His-tag)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；毒株狂犬病病毒CTN-1株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶RⅠ和Ⅰ，T4 DNA連接酶均購(gòu)自BioLab；Trizol、DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗人抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Primer StarMax(2×)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白熒光標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Innova Bioscience；人狂犬病免疫球蛋白購(gòu)自廣東雙林生物制藥有限公司。CD19、CD27抗體購(gòu)自美國(guó)BD生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)狂犬病病毒CTN-1株基因的序列 (GenBank登錄號(hào)為FJ959397.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)狂犬病毒CTN-1株基因全長(zhǎng)序列(1575bp)和膜外區(qū)去除信號(hào)肽序列(1308bp)的引物，并在上下游引物中分別引入酶切位點(diǎn)RⅠ和Ⅰ(用下劃線(xiàn)表示)，見(jiàn)表1。Trizol法提取病毒RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增。用RⅠ和Ⅰ對(duì)擴(kuò)增出的DNA片段和載體pGEX-5X-1、pET28a、pET30a進(jìn)行雙酶切，然后將酶切后的載體pGEX-5X-1和pET28a與基因全長(zhǎng)序列連接，載體pET30a和基因膜外區(qū)連接，16℃過(guò)夜，將連接后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到.DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定，并送鉑尚生物技術(shù) (上海) 有限公司測(cè)序。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G。

1.2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定為陽(yáng)性的表達(dá)載體的pGEX-5X-1-RVG轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)中，pET28a-RVG、pET30a-G轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)中；挑取重組工程菌接種于含有1%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床過(guò)夜；將培養(yǎng)物按1∶50的比例接種至10mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)約3h至菌液600為0.6時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.5mmol/L，溫度為16℃，誘導(dǎo)12h。收集菌體，超聲波破菌后，4℃、8000r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況。其中，載體pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG、pET30a-G對(duì)應(yīng)表達(dá)的重組蛋白形式分別為GST-RVG(約85.2kDa)、His-RVG(約62.4kDa)、His-G(約54.8kDa)。同時(shí)用空載體pGEX-5X-1、pET28a和pET30a作為陰性對(duì)照。

表1 重組蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建所用引物及其序列

Restriction sites were underlined.

1.2.3蛋白純化

根據(jù)目的蛋白所帶標(biāo)簽和表達(dá)情況的不同，選擇不同的純化方法。其中蛋白GST-RVG采用GST親和層析柱純化；蛋白His-RVG采用陰離子柱層析和鎳柱親和層析純化；蛋白His-G采用包涵體變性復(fù)性的方法純化。

1.2.4重組蛋白的抗原特異性鑒定

采用Westernblotting鑒定。純化后重組蛋白GST-RVG、His-RVG、His-G經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉1h，加入抗狂犬病病毒免疫球蛋白(1∶10000)，室溫孵育2h；TBST洗滌3次，每次5min，再加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶30000稀釋)，室溫孵育1h；TBST洗滌4次，每次10min；ECL顯影。

1.2.5 重組蛋白與抗狂犬病病毒免疫球蛋白的親和力檢測(cè)

通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法來(lái)檢測(cè)純化后重組蛋白與狂犬免疫球蛋白的親和力大小。用純化后的重組蛋白包被兩塊抗原板，4℃過(guò)夜，用PBST洗板3次后，用3%的MPBS(MPBS即含有脫脂奶粉的PBS)室溫封閉2h，PBST洗板3次；在一排12個(gè)試管中，建立從0.1nmol/L–1 μmol/L濃度梯度的抗原即蛋白PBS溶液，加入終濃度為0.5nmol/L的抗狂犬病病毒抗體，加入抗體溶液使總體積為100μL，室溫孵育30min后，加入90μL反應(yīng)混合物到前述已被包被抗原的微孔中，微孔中預(yù)先加入30μL的30%MPBS后孵育，時(shí)間不超過(guò)10min；孵育結(jié)束后，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入另一塊包被抗原的板中，第二塊板的ELISA操作與第一塊相同。充分洗滌第一塊和第二塊板，加入帶HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1:750稀釋)，室溫1h，PBST洗板3次，加入TMB顯色液100μL/孔，37℃避光10min，加入2mol/LH2SO4終止反應(yīng)；檢測(cè)各孔的吸光度值。在半飽和狀態(tài)下(ELISA信號(hào)強(qiáng)度是最高強(qiáng)度的一半) 所得到的抗原濃度約等于解離常數(shù)dis(dis=/，為蛋白總濃度，為蛋白稀釋倍數(shù)，為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量)，解離常數(shù)的倒數(shù)即為親和力。

1.2.6 免疫后血清中抗狂犬病病毒抗體水平檢測(cè)

采用間接ELISA法。志愿者按照暴露前程序接受狂犬疫苗接種，在接種第3針后14 d，采集志愿者血液5mL，分離血清。將純化的GST-RVG包被酶標(biāo)板，包被液為碳酸鹽緩沖液(pH9.6)，每孔0.7μg蛋白，4℃過(guò)夜；PBST洗板3次后，用1%BSA封閉液室溫封閉1h；洗板3次，加入稀釋的陰性血清 (志愿者免疫前血清)，狂犬病毒免疫球蛋白以及志愿者免疫后血清 (稀釋倍數(shù)為1∶6400)，室溫孵育2h；洗板3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗人二抗 (1∶750稀釋)，孵育1h后加入TMB顯色液100μL/孔，37℃避光10min，加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)；檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.7 GST-RVG標(biāo)記FITC

使用Lightning-Link熒光標(biāo)記試劑盒。將 1 mL GST-RVG (516μg/mL) 和100 μL LL-modifier reagent混勻后，加入到Lightning-Link?mix中輕輕混勻，避光，4℃過(guò)夜后，加入100μL LL-quencher FD reagent，放置30min。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)特異性結(jié)合記憶性B細(xì)胞

采用流式細(xì)胞術(shù)。志愿者按照暴露前程序接受狂犬疫苗接種，在接種第3針后14 d，采集志愿者血液5mL，用來(lái)分離外周血淋巴細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。將ELISA鑒定為陽(yáng)性志愿者的PBMCs樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，并將接種疫苗前的血清和PBMCs作為陰性對(duì)照。將凍存的PBMCs復(fù)蘇后，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到約1×106個(gè)1管，PBS洗滌2次，離心后棄上清。為確定最佳的標(biāo)記蛋白使用量，我們分別采用10、20、40 μg的GST-RVG-FITC對(duì)PBMCs進(jìn)行細(xì)胞染色，同時(shí)加入10μLanti-CD19-PE抗體，10μLanti-CD27-APC[16]抗體4℃避光30min，用PBS洗滌，離心后棄上清，加入200μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分選。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，載體片段、全長(zhǎng)序列 (1 575 bp) 和膜外區(qū)序列 (1308bp) 的基因片段均與預(yù)期相符 (圖1A和1B)；測(cè)序結(jié)果與GenBank標(biāo)準(zhǔn)序列一致，表明質(zhì)粒pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G均構(gòu)建成功。

2.2 目的基因誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

12%SDS-PAGE結(jié)果顯示，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為85kDa (pGEX-5X-1-RVG)、62 kDa (pET28a-RVG)和55kDa (pET30a-G) 的目的蛋白條帶，大小均與預(yù)期相符，且GST-RVG、His-RVG在添加1%葡萄糖培養(yǎng)表達(dá)量明顯增多，見(jiàn)圖2。

圖1 重組蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.3 純化產(chǎn)物的鑒定

12%SDS-PAGE分析純化上述表達(dá)蛋白，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為85kDa (親和層析)、62 kDa(陰離子交換層析和親和層析) 和55 kDa (包涵體變性復(fù)性) 大小條帶 (圖3A)。Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，GST-RVG：516μg/mL，His-RVG：1224μg/mL，His-G：320μg/mL。Scion Image灰度掃描計(jì)算蛋白純度，GST-RVG：87.12%，His-RVG：23.1%，His-G：95.2%，見(jiàn)表2。Westernblotting結(jié)果顯示，純化后蛋白均可與人狂犬病毒免疫球蛋白特異性結(jié)合 (圖3B)。

圖3 純化后蛋白SDS-PAGE(A)和Western boltting (B)鑒定

2.4 重組蛋白與抗狂犬病病毒抗體的親和力檢測(cè)

競(jìng)爭(zhēng)ELISA法結(jié)果顯示，純化后不同蛋白與人狂犬病毒免疫球蛋白的親和力大小分別為：GST-RVG：1.38×108L/mol，His-RVG：5.1×107L/mol，His-G：1.7×105L/mol，結(jié)果見(jiàn)表2。通常，抗原抗體反應(yīng)的親和常數(shù)a(Affinity constant)小于105L/mol為低親和力，107–108L/mol為中等親和力，大于108L/mol為高等親和力。故GST-RVG與人狂犬病毒免疫球蛋白為高親和力結(jié)合，His-RVG與特異性抗體屬于中等親和力結(jié)合，His-G與則以低親和力結(jié)合特異性抗體。由此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用GST-RVG作為陽(yáng)性血清和特異性B細(xì)胞的候選抗原進(jìn)行分析。

表2 純化后蛋白的分析比較

2.5 免疫后血清中抗狂犬病病毒抗體水平 檢測(cè)

為了進(jìn)行特異性單個(gè)記憶性B細(xì)胞的分選，我們對(duì)志愿者免疫前后的血清進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，高親和力的GST-RVG可用于免疫后血清樣本的分析檢測(cè)，與親和力的計(jì)算結(jié)果吻合，由此，我們最終確認(rèn)GST-RVG用于記憶B細(xì)胞的分選 (圖4)。且當(dāng)血清稀釋度為6 400倍時(shí)，陰性血清和志愿者1的免疫后血清450值相比<0.01(**)，差異具有較強(qiáng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性血清和人狂犬病毒免疫球蛋白450值相比<0.05(*)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇志愿者1的PBMCs進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)分選特異性結(jié)合記憶性B 細(xì)胞

在比較了10、20和40 μg GST-RVG-FITC染色1×106個(gè)PBMCs的熒光信號(hào)強(qiáng)弱后，確定以20 μg GST-RVG-FITC標(biāo)記1×106個(gè)PBMCs，隨后采用anti-CD19-PE抗體 (CD19，B細(xì)胞特異性表面分子)、anti-CD27-APC抗體 (CD27，記憶B細(xì)胞特異性表面分子) 和GST-RVG-FITC進(jìn)行狂犬病毒抗原特異性記憶B細(xì)胞的分選，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組 (免疫前)和實(shí)驗(yàn)組 (免疫后) 的B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞分群及所占比例情況基本一致(圖5B、C、F、G)；陰性對(duì)照組中記憶B細(xì)胞 (CD19+和CD27+) 能識(shí)別GST-RVG而被GST-RVG-FITC染色的數(shù)量極少，而實(shí)驗(yàn)組中有相當(dāng)數(shù)量的FITC陽(yáng)性記憶B細(xì)胞 (CD19+和CD27+)，提示實(shí)驗(yàn)組中GST-RVG可以特異性結(jié)合記憶B細(xì)胞。如圖5D、5H所示，我們選取了GST-RVG-FITC染色標(biāo)記的部分記憶B細(xì)胞，初步比較了陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間的差別，即0% vs 8.11%。實(shí)驗(yàn)組中GST-RVG-FITC染色的記憶B細(xì)胞，可能含有抗狂犬病病毒抗體基因的B細(xì)胞克隆。

圖4 間接ELISA檢測(cè)免疫后志愿者血清抗體結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用基因工程的方法構(gòu)建了pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G三個(gè)原核表達(dá)載體。通過(guò)不同溫度、添加葡萄糖等誘表達(dá)條件的摸索，獲得了大小分別為85kDa(GST-RVG)、62 kDa(His-RVG)及 55 kDa(His-G)的重組蛋白。經(jīng)過(guò)不同純化方法獲得的3種蛋白，Western blotting結(jié)果顯示均能夠與陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性ELISA[17]結(jié)果顯示，3個(gè)蛋白中，僅GST-RVG與抗狂犬病病毒抗體為較高親和力結(jié)合。隨后，以GST-RVG為初步候選抗原進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，間接ELISA結(jié)果顯示GST-RVG能夠用于檢測(cè)狂犬病毒疫苗免疫后志愿者血清抗體水平高低，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記GST-RVG后，結(jié)合CD19、CD27抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)志愿者1的PBMCs，可以檢測(cè)分選到抗原特異性的記憶B細(xì)胞。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析PBMC的抗狂犬病病毒記憶B細(xì)胞

采用原核系統(tǒng)表達(dá)RVG是一個(gè)快速有效獲得目的蛋白的方法[18]。本實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化并分析了帶不同標(biāo)簽的不同分子量的糖蛋白。由于膜蛋白的高度疏水性和錯(cuò)誤的折疊可能引起蛋白聚集，從而導(dǎo)致快速降解或是形成沉淀，故膜蛋白通常很難大量表達(dá)和純化。但是如果膜蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，這個(gè)問(wèn)題可以在一定程度上得到緩解[19]?？赡艿脑虬ǎ?) 狂犬病毒G蛋白胞外區(qū)蛋白 (His-G) 是帶有6×His標(biāo)簽的重組蛋白，其標(biāo)簽對(duì)目的蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響相對(duì)較小。His-G表達(dá)量高，但多以包涵體的形式存在，針對(duì)包涵體變性、復(fù)性和后續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其與陽(yáng)性血清結(jié)合的親和力較低，原因可能是狂犬病毒胞外區(qū)G蛋白的不完整性部分制約了其生物學(xué)功能[20]，變性和復(fù)性也可能影響了其折疊及功能[21]。2) 對(duì)于重組蛋白His-RVG，由于RVG全長(zhǎng)基因信號(hào)肽、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)含有大量的稀有密碼子，導(dǎo)致RVG全長(zhǎng)基因難以獲得高表達(dá)[22]，超聲菌體上清中包含少量His-RVG，而在添加1%葡萄糖培養(yǎng)后，其表達(dá)量明顯增高，可能原因是完整的狂犬病毒G蛋白在此表達(dá)系統(tǒng)中毒性較大[23]，宿主菌受到了抑制，1%的葡萄糖可以抑制毒性增強(qiáng)表達(dá)。但對(duì)其上清進(jìn)行離子交換和親和層析后，得到的His-RVG純度偏低，雜蛋白可能會(huì)影響His-RVG與免疫球蛋白的結(jié)合，無(wú)法在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用。3) 對(duì)于重組蛋白GST-RVG，GST是一種高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性[24]。親和層析純化獲得了純度、濃度均滿(mǎn)足我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡腉ST-RVG，具備和抗體高親和力結(jié)合的特性 (a=1.38×108L/mol)，流式細(xì)胞技術(shù)顯示GST-RVG能夠和抗原特異性記憶B細(xì)胞結(jié)合，分離特異性群落的分群顯示為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0.15%。鑒于其與特異性細(xì)胞結(jié)合的高親和力特性，該候選蛋白還可用來(lái)判斷疫苗接種后的免疫效果及毒株間的抗原性比較。

目前，狂犬病的防治主要是通過(guò)疫苗進(jìn)行預(yù)防和使用免疫球蛋白進(jìn)行緊急治療，但免疫球蛋白多來(lái)源于馬及人血清，異源性和副作用導(dǎo)致了免疫球蛋白的使用受限[25]。單個(gè)特異性記憶性B細(xì)胞分選制備單克隆抗體是一種制備單克隆抗體的新型方法，該方法的關(guān)鍵點(diǎn)是分選得到單個(gè)抗原特異性記憶性B細(xì)胞，如何獲得用于分選的高要求抗原至關(guān)重要。本研究基于表達(dá)不同的狂犬病病毒糖蛋白，進(jìn)而選擇具有較高純度以及與陽(yáng)性血清具有較高親和力特性的蛋白，用于篩選抗狂犬病病毒糖蛋白的記憶性B細(xì)胞，為分離純化得到單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression and purification of rabies virus glycoprotein and analysis of its specific binding capacity to memory B cells

Liwei Yan, Wei Gong, Wenbing Zhu, Xuemei Zhang, Jingwen Xu, Zhongxiang Wu, Kongjie Lu, Ming Sun, and Shaozhong Dong

Yunnan Provincial Key Laboratory for Development of Vaccines Against Major Infectious Diseases,Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,650118,,

We aimed to express and purify three rabies virus glycoproteins with different tags and sizes. After analyzing their binding function, we wish to obtain a rabies virus glycoprotein with higher affinity and ability to specifically bind memory B cells. Experiments were carried out to express full length, as well as the ectodomain RVG by gene engineering method. Combined with the antibody of CD19 and CD27, the candidate protein labeling with fluorescence was used to analyze its binding function. Flow cytometry was used to detect the anti-rabies virus specific memory B cells in PBMCs, and confirm the binding ability between the candidate proteins and anti-rabies virus-specific memory B cells. We successfully constructed three expression vectors pGEX-5X-1-RVG, pET28a-RVG and pET30a-G. Three glycoproteins GST-RVG, His-RVG and His-G were obtained by optimized expression and purification conditions. The antigen specificity of purified GST-RVG, His-RVG and His-G were identified by Western blotting and ELISA. The affinity of these three purified glycoproteins to anti-rabies virus antibody were detected by competitive ELISA. Anti-rabies virus specific memory B cells in positive PBMCs gained from people who had ever been injected with the vaccine can be detected by flow cytometry. Thus, we got a recombinant rabies virus glycoprotein that had high-affinity and could sort antigen specific memory B cells.

rabies virus glycoprotein, antigen specific memory B cells,flow cytometry

February 21, 2017;

May 8, 2017

Shaozhong Dong. Tel: +86-871-68335116; E-mail: dsz@imbcams.com.cn Ming Sun. Tel: +86-871-68339287; E-mail: sunming@imbcams.com.cn

Supported by:CAMS Innovation Fund for Medical Sciences Program (No. 2016-I2M-1-019).

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程重大協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目 (No. 2016-I2M-1-019) 資助。

2017-05-17

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