張莉芳 廖煥金 蔡 珺 何一鳴 彭艷霞 李光民 謝 彤 吳 平 劉華鋒 潘慶軍

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湛江524001)

記憶性B細胞體外擴增影響因素的研究進展①

張莉芳 廖煥金②蔡 珺③何一鳴④彭艷霞③李光民③謝 彤④吳 平 劉華鋒③潘慶軍③

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湛江524001)

記憶性B細胞(Memory B cells)是成熟的初始B細胞被抗原激活分化為具有記憶功能并持續(xù)存在于宿主的一類細胞。當再次遇到相同抗原時，該細胞可迅速增殖分化為漿細胞，產(chǎn)生高親和力的抗原特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，從而保護機體免受再次入侵的抗原感染[1,2]。

記憶性B細胞在機體體液免疫應(yīng)答和疫苗開發(fā)中具有重要作用。通過對記憶性B細胞的研究，不僅能加深人們對記憶性B細胞生理特性和免疫記憶的認識，而且能推動疫苗的設(shè)計開發(fā)，以及為體外生產(chǎn)大量抗體提供理論依據(jù)。然而，由于記憶性B細胞在外周血中的數(shù)量較少，并且沒有一種精確檢測和分離的方法，導(dǎo)致人們對記憶性B細胞的生理特性和再次參與免疫應(yīng)答的研究滯后[3]。因此，探索體外檢測、活化和擴增記憶性B細胞的方法至關(guān)重要。本文就記憶性B細胞在體外檢測、活化及擴增的影響因素作簡要綜述。

1 記憶性B細胞

記憶性B細胞被定義為：在入侵的抗原被清除后，接觸過抗原并持續(xù)存在于宿主中的一類細胞，當再次遇到相同抗原時，該細胞能快速應(yīng)答產(chǎn)生高親和力的抗原特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[1,2]。人記憶性B細胞主要分為兩類[4,5]：①免疫球蛋白轉(zhuǎn)換的記憶性B細胞 (CD27+IgD-IgG+/IgA+/IgE+)；②非轉(zhuǎn)換IgM+記憶性B細胞，包括CD27+IgM+IgD-和CD27+IgM+IgD+的細胞亞群。雖然近期研究發(fā)現(xiàn)一群不表達CD27的B細胞也具有記憶性B細胞的特性[6]，但是，大家仍普遍認為腫瘤壞死因子受體家族成員CD27可作為人記憶性B細胞的表面標記物[7]。

抗體的產(chǎn)生和抗體記憶是體液免疫的基本功能。在感染或接種疫苗后，基于B細胞表達的B細胞受體(B cell receptor,BCR)對外來抗原的識別，成熟的初始B細胞被激活并分化為記憶性B細胞和漿細胞，從而使機體具有免疫記憶功能[8,9]。維持機體免疫記憶的細胞主要是長壽命漿細胞和記憶性B細胞。長壽命漿細胞定居于骨髓中，持續(xù)分泌抗體，中和入侵的病原微生物，執(zhí)行免疫保護功能；記憶性B細胞則主要循環(huán)于外周血或定居于次級淋巴組織和骨髓中[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)，當機體再次接觸相同抗原時，IgG+B細胞可快速被活化并增殖分化為產(chǎn)生高滴度、高親和力的IgG抗體分泌型細胞，以便能更有效清除入侵的病原體[8,12]。此外，在抵抗細菌和病毒入侵時，記憶性B細胞除了分化為漿細胞產(chǎn)生抗體外，還可通過產(chǎn)生細胞因子或提呈抗原給T細胞，從而影響免疫性疾病的進展[13]。

2 記憶性B細胞體外檢測方法的研究進展

傳統(tǒng)上，血清抗體滴度的檢測是反映機體疫苗接種后體液免疫應(yīng)答能力的最常用方法，主要是此方法簡單，成本低。目前，市場上的絕大多數(shù)疫苗的免疫力都可通過抗體滴度來檢測[2,14,15]。然而，長期的體液免疫記憶不僅依靠長壽命漿細胞產(chǎn)生的抗體，同時也依賴于記憶性B細胞再次暴露在抗原時快速分化為漿細胞的能力[3]。也可通過檢測記憶性B細胞的種類和數(shù)量來確定體液免疫應(yīng)答的強度和范圍[16]。所以，即使血清抗體滴度的檢測結(jié)果為陰性，記憶性B細胞也可能大量存在，不過只是處于靜息狀態(tài)[15]。單獨檢測免疫后血清的抗體滴度不足以反映機體的免疫記憶能力[17]，如果聯(lián)合檢測抗體和記憶性B細胞的水平就更能體現(xiàn)人B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力。

目前，記憶性B細胞的檢測方法主要有兩種：①采取熒光素標記的單體或四聚體抗原直接與記憶性B細胞結(jié)合，再通過多色流式細胞儀檢測，即可檢測出記憶性B細胞的數(shù)量和種類[18,19]；②體外用多克隆刺激劑預(yù)刺激記憶性B細胞，培養(yǎng)一定時間，待其分化為抗體分泌細胞(Antibody-secreting cells,ASC)后，通過酶聯(lián)免疫斑點試驗(Enzyme-linked immunospot,ELISPOT)或酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測ASC分泌抗體的數(shù)量，從而達到對記憶性B細胞檢測的目的[20,21]。但是，由于記憶性B細胞在外周血中的數(shù)量較少，約占人外周血B細胞的30%～40%[5]，尚且無精確檢測和分離記憶性B細胞的有效方法。

1983年，ELISPOT實驗第一次用于檢測B細胞，發(fā)現(xiàn)可以識別分泌IgG的B細胞[22]。研究發(fā)現(xiàn)ELISPOT試驗是檢測記憶性B細胞和漿細胞的重要方法。存在于外周血中的漿細胞不用體外預(yù)活化，通過ELISPOT試驗即可檢測出來，但只有在抗原入侵或免疫后的特定時間才可檢測到[23]。記憶性B細胞則需預(yù)刺激5～6 d[21]，甚至更長時間[5]，待其激活分化為ASC后才能在ELISPOT板上檢測到。刺激時間的長短，主要與刺激劑、細胞活化潛能和細胞的純度(如PBMC、B細胞或提純的記憶性B細胞)有關(guān)[23]。目前，ELISPOT試驗不僅能評估記憶性B細胞分泌的抗體是否發(fā)生類別的轉(zhuǎn)換，而且能評估記憶性B細胞在外周循環(huán)的數(shù)量，現(xiàn)已廣泛運用于疫苗接種學(xué)、腫瘤免疫治療學(xué)和移植免疫學(xué)等領(lǐng)域[24]。

3 記憶性B細胞體外活化方案

如何活化記憶性B細胞是在體外研究其生理特性時首先要解決的問題。因此，為精確評估記憶性B細胞的功能特性，探索快速有效的B細胞活化方案至關(guān)重要。

初始B細胞活化的經(jīng)典途徑涉及到B細胞與抗原特異性結(jié)合以及抗原特異性T、B淋巴細胞相互識別的過程[25]。但鑒于記憶性B細胞的功能特性與初始B細胞不同，兩者可能存在不同的活化方式。因此，研究者開始探索非抗原依賴的記憶性B細胞活化方案。研究發(fā)現(xiàn)，用非抗原依賴的多克隆刺激劑與其他刺激物聯(lián)合使用，能使大部分記憶性B細胞分化為ASC[26]。此外，Crotty等[21]聯(lián)合使用PWM(Pokeweed mitogen,PWM)+CpG (Cytosine-phosphate-guanine,CpG)+SAC(Staphylococcus aureus Cowan,SAC)于體外培養(yǎng)6 d，可以使抗原特異性記憶性B細胞(Antigen-specific memory B cell)分化為ASC。2014年，Huang等[27]聯(lián)合使用SAC、CpG和PWM刺激記憶性B細胞，通過ELISPOT試驗檢測，發(fā)現(xiàn)記憶性B細胞能分化為ASC，并產(chǎn)生大量抗體，表明在體外通過非抗原依賴的多克隆刺激，記憶性B細胞能分化為ASC。

隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用多克隆刺激劑如CpG、PWM、SAC與CD40L或細胞因子IL-2 和IL-10等刺激記憶性B細胞，能更有效地讓其活化。Dugas等[28]用CD40-CD154體外培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，來源于持續(xù)性多克隆B淋巴細胞增多癥(Persistent polyclonal B cell lymphocytosis,PPBL) 的記憶性B細胞可大量增殖并分泌IgM和IgG，表明通過CD40可活化記憶性B細胞，使其增殖。同年，Ghamlouch等[5]聯(lián)合使用CpG、CD40L、IL-2、IL-10 和IL-15與來源于慢性B淋巴細胞白血病的記憶性B細胞共培養(yǎng)7 d，發(fā)現(xiàn)記憶性B細胞能分化為ASC，并分泌大量的IgM。此外，Karahan等[24]聯(lián)合使用α-CD40單克隆抗體、ODN-2006(Oligodeoxy-nuc-leotides(ODN)-2006)、CpG、IL-2、IL-10和IL-21與記憶性B細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)記憶性B細胞可活化增殖并分化為ASC，認為該刺激方案可有效激活記憶性B細胞。

目前，研究者提出聯(lián)合使用R848(TLR7和TLR8激動劑)和IL-2才是刺激記憶性B細胞活化的最有效方案。2009年，Pinna等[29]評估記憶性B細胞的活化方案時，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用R848和IL-2刺激記憶性B細胞6天后的活化效果，優(yōu)于聯(lián)合使用PWM、CpG和SAC。2013年，Jahnmatz等[23]通過對多種刺激B細胞活化的方案進行對比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用R848+IL-2預(yù)刺激72 h后，能最有效地使記憶性B細胞活化增殖并分泌IgG。與其他方案相比，該方案可提高檢測抗原特異性記憶性B細胞的靈敏度。同年，Walsh等[30]聯(lián)合使用R848+IL-2刺激記憶性B細胞5 d后，亦可誘導(dǎo)HIV特異性的記憶性B細胞分化為ASC。如今，聯(lián)合使用R848和IL-2刺激記憶性B細胞活化的方案已逐漸被眾多實驗室認可。

雖然已有多種方案能使記憶性B細胞活化并增殖，但記憶性B細胞是如何接受環(huán)境信號刺激以及其非特異性多克隆激活的規(guī)律仍無確切結(jié)論，有待深入研究。

4 活化擴增抗原特異性記憶性B細胞的方法

隨著檢測方法和記憶性B細胞活化方案的優(yōu)化，目前已有多種方案能使外周血中的記憶性B細胞分化為ASC并產(chǎn)生相關(guān)抗體。但是，這種活化方式是一種非特異性多克隆激活，分泌的是多克隆抗體。于是，研究者開始探索如何從眾多活化的記憶性B細胞中篩選出針對某種抗原的抗原特異性記憶性B細胞。

目前，最常用的方法是通過疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性記憶性B細胞，再通過體外多克隆刺激劑使其活化擴增，在ELISPOT板上篩選獲得針對這種疫苗的抗原特異性記憶性B細胞。2004年，Crotty等[21]聯(lián)合應(yīng)用PWM、CpG和SAC刺激從炭疽疫苗接種者中分離出的記憶性B細胞，在ELISPOT實驗中檢測發(fā)現(xiàn)炭疽特異性記憶性B細胞能分化為ASC，分泌保護性抗體，并證明該記憶性B細胞屬于IgG+亞群。2011年，Morris等[31]從HIV-1疫苗接種者外周血中分離出單個B細胞，克隆得到能識別HIV-1gp41保守位點及能中和多株HIV-1的抗體，并認為在HIV-1gp41包被蛋白的C端存在多免疫原性靶點，可為單個B細胞抗體制備技術(shù)及疫苗設(shè)計提供依據(jù)。此外，Buisman等[26]在研究疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性的記憶性B細胞應(yīng)答時，發(fā)現(xiàn)每毫升血液中約有10個抗原特異性記憶性B細胞，并由此推算人的機體約有6×104個抗原特異性記憶性B細胞。

近年，聯(lián)合應(yīng)用ELISPOT試驗方法和多克隆刺激劑，相繼檢測出了HIV特異性記憶性B細胞、惡性瘧原蟲特異性記憶性B細胞，Ro/SSA-和La/SSB特異性記憶性B細胞[31-33]等。隨著檢測方法和活化方案的優(yōu)化，必將會有越來越多的抗原特異性記憶性B細胞被檢測出來，為疫苗的設(shè)計及開發(fā)提供理論依據(jù)。

5 體外檢測、活化及擴增記憶性B細胞的意義

免疫記憶是免疫系統(tǒng)中最顯著的特點。無論體液免疫或細胞免疫，再次應(yīng)答都具有迅速、強烈、特異性高和持久的特點[34]。但記憶性B細胞是如何接受環(huán)境信號刺激以及其非特異性多克隆激活的機制尚不明確。因此，通過體外檢測、活化和擴增記憶性B細胞，不但能加深人們對記憶性B細胞功能特性和免疫記憶功能的認識，使深入研究人體免疫記憶功能和機理成為可能，為體外制備全人源性抗體提供相關(guān)理論依據(jù)。

在疫苗領(lǐng)域，體外檢測、活化及擴增記憶性B細胞對疫苗的設(shè)計開發(fā)具有重要意義[15]。檢測記憶性B細胞的應(yīng)答可評估疫苗的效能，并可篩選出對感染性疾病或癌癥免疫治療的疫苗無反應(yīng)的風(fēng)險群體[20，32]。同時，從免疫或感染個體中分離出的抗體有助于我們分析該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體類型、生理功能并指導(dǎo)相關(guān)疫苗的設(shè)計和開發(fā)[15]。因此，檢測外周記憶性B細胞的應(yīng)答能力可為我們評估疫苗的療效及疫苗對人體的保護時間提供相關(guān)理論依據(jù)[35]。

體外擴增記憶性B細胞制備抗體技術(shù)是一種潛在制備全人源性抗體的方法。目前，實驗技術(shù)尚不能通過體外細胞培養(yǎng)獲得大量的人多克隆抗體，而臨床上運用的治療性免疫球蛋白多克隆制劑或靜脈注射的免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulins，IVIg)是志愿者的血漿中分離出來的，其主要成分為IgG，因其來源途徑的限制，導(dǎo)致IVIg相當緊缺[36]。因此，通過體外檢測、活化和擴增記憶性B細胞有望在體外產(chǎn)生大量的全人源性多克隆抗體，以增加IVIg的來源。研究發(fā)現(xiàn)，利用多克隆刺激劑可誘導(dǎo)人記憶性B細胞向漿細胞轉(zhuǎn)換，分泌大量的多克隆抗體，并證明了該抗體與正常人血清的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4功能結(jié)構(gòu)相似[37]。此外，擴增的記憶性B細胞也可結(jié)合單個B細胞抗體技術(shù)，生產(chǎn)混合的人單克隆抗體。研究表明單個B細胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體，具有全人源性、自身高度特異性和均一性的特點，在治療病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病及器官移植等方面有獨特的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景[34]。

綜上，通過體外活化和擴增記憶性B細胞，不僅有助于對記憶性B細胞功能特性及免疫記憶功能的認識，而且為人工構(gòu)建親和力和特異性更高的抗體提供理論依據(jù)，將推動免疫學(xué)在醫(yī)學(xué)預(yù)防、治療等方面的應(yīng)用與發(fā)展。

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[收稿2016-02-19 修回2016-03-09]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.031

①本文受國家自然科學(xué)基金(81471530)、廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313526)和廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金(A2014481)資助。

張莉芳(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事自身免疫性疾病發(fā)病機制研究。

及指導(dǎo)教師：吳 平(1962年-)，男，博士，主任技師，主要從事風(fēng)濕免疫性疾病發(fā)病機制研究，E-mail：wpin62@126.com。 潘慶軍(1978年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫性疾病防治研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

R392

A

1000-484X(2017)01-0144-04

②并列第一作者。

③廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江524001。

④廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湛江524001。