李愷，宋雷，石文昊，田喜鳳

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雙反相色譜串聯(lián)平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)靶向定量蛋白質(zhì)組方法的建立

李愷1,2，宋雷2，石文昊2，田喜鳳1,3

1 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)學(xué)科，河北唐山 063009 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·北京北京蛋白質(zhì)組研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206 3 河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063000

李愷, 宋雷, 石文昊, 等. 雙反相色譜串聯(lián)平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)靶向定量蛋白質(zhì)組方法的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(11): 1859–1868.Li K, Song L, Shi WH, et al. Establishment of Dual Reverse Phase Chromatography combined Parallel Reaction Monitoring for targeted quantitative proteomics. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1859–1868.

近年來質(zhì)譜技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步促進(jìn)了靶向蛋白質(zhì)組的發(fā)展，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Multiple reaction monitoring，MRM) 靶向蛋白質(zhì)組定量方法的基礎(chǔ)上衍生出平行反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Parallel reaction monitoring，PRM)技術(shù)。該技術(shù)靶向定量靈敏度和通量更高，重現(xiàn)性也更好，但其對(duì)于高復(fù)雜性樣本在定量速度和深度上均存在一定的局限性。改善PRM定量的色譜方法包括：色譜柱的優(yōu)化，增加色譜柱內(nèi)徑、降低柱長；色譜洗脫條件的優(yōu)化，提高液相洗脫流速、縮短洗脫時(shí)間；最終建立了一種簡(jiǎn)單高效的雙反相色譜串聯(lián)PRM靶向蛋白質(zhì)組定量平臺(tái)。該平臺(tái)使用150 μm內(nèi)徑和8 cm長的短色譜柱，在800 nL/min的高流速下和35 min有效洗脫梯度內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)293T全細(xì)胞裂解液蛋白樣本中多達(dá)400條低豐度肽段的快速定量。該研究優(yōu)化了PRM靶向定量方法，將有利于PRM技術(shù)的推廣，尤其為低豐度蛋白的精準(zhǔn)定量提供了一種技術(shù)選擇。

雙反相色譜，平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)，靶向定量

近年來隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)越來越多地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。數(shù)據(jù)依賴性采集方法 (Data dependent acquisition，DDA) 是蛋白質(zhì)組學(xué)無標(biāo)定量的常用技術(shù)手段，該方法采用的是基于一級(jí)色譜峰的定量方式，定量的深度不足，尤其是對(duì)低豐度蛋白定量準(zhǔn)確性差。Ding等[1]通過結(jié)合雙反相色譜正交法，即pH 10的反相色譜降低樣本復(fù)雜程度[2]后利用pH 3的反相色譜串聯(lián)高精度質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本鑒定[3]，通過縮短洗脫梯度等提升了質(zhì)譜檢測(cè)深度，使得質(zhì)譜檢測(cè)效率大大提高。

多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Multiple reaction monitoring，MRM) 蛋白靶向定量方法得到廣泛關(guān)注[4-5]，并有取代實(shí)驗(yàn)室蛋白定量黃金標(biāo)準(zhǔn)Western blotting方法的勢(shì)頭[6]。該方法在一定時(shí)間窗口內(nèi)對(duì)預(yù)設(shè)的一系列母離子-子離子對(duì)進(jìn)行定量檢測(cè)[7-8]，檢測(cè)結(jié)果在一定動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)擁有較高的準(zhǔn)確性。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析對(duì)通量要求的提升，MRM的靈敏度和分辨率成為離子對(duì)檢測(cè)通量的限制因素[9]。此外，基于三重四極桿的MRM方法，在高復(fù)雜性樣本檢測(cè)過程中由于分辨率偏低對(duì)共洗脫肽段無法進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，容易造成目標(biāo)肽段定量結(jié)果的假陽性[10-12]。MRM方法中離子對(duì)選擇[13]、碰撞能量等條件優(yōu)化過程繁瑣，難以滿足生物標(biāo)志物和系統(tǒng)生物學(xué)等研究中靶向定量蛋白質(zhì)組的高通量需求[14-15]。

在大規(guī)模靶向定量分析的實(shí)際應(yīng)用中，基于MRM發(fā)展而來的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Parallel reaction monitoring，PRM) 蛋白靶向定量技術(shù)不需篩選碎片離子，利用高分辨的軌道離子阱對(duì)所有碎片離子進(jìn)行檢測(cè)，降低了干擾離子對(duì)結(jié)果的影響。PRM方法能夠在高通量的檢測(cè)過程中保證定量的靈敏度和特異性[16-17]。Gallien等利用60 min有效梯度鑒定了酵母全蛋白裂解液中的770條肽段[18]；Kim等將PRM技術(shù)用于酪氨酸激酶的大規(guī)模定量分析，最終在50 min有效梯度內(nèi)準(zhǔn)確定量了83種酪氨酸激酶受體的308條肽段[19]。在翻譯后修飾的研究當(dāng)中Tsuchiya等[20]和Tang等[21]均利用PRM技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和定量。近期在羊絨分子標(biāo)志物鑒定[22]和單克隆抗體藥物的表征研究[23]中均利用了PRM檢測(cè)技術(shù)?？傊琍RM漸漸成為靶向蛋白質(zhì)組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的方法之一。

質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使得儀器靈敏度、分辨率等均有提升，但對(duì)于高復(fù)雜性樣本的鑒定效率無明顯提高，Shishkova等通過對(duì)比近年已發(fā)表文章的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)色譜條件可能是潛在的制約因素[24]。為了提高PRM靶向定量檢測(cè)的通量和深度、準(zhǔn)確性以及重復(fù)性，我們建立了一種簡(jiǎn)單高效的雙反相色譜串聯(lián)PRM靶向蛋白質(zhì)組定量平臺(tái)。相對(duì)于傳統(tǒng)的定量方法，我們主要優(yōu)化了PRM定量的色譜方法，包括：1) 色譜柱的優(yōu)化：增加色譜柱內(nèi)徑、降低柱長；2) 色譜洗脫條件的優(yōu)化；3) 提高液相洗脫流速、縮短洗脫時(shí)間。該研究提高了PRM蛋白質(zhì)組靶向定量的通量和深度，為其更廣泛的應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate 3000納升級(jí)液相色譜儀和Q Exactive HF質(zhì)譜儀 (美國Thermo Fisher公司)。

質(zhì)譜級(jí)水、乙腈、甲醇 (J.T.Baker公司)，1.9 μm C18粉末 (Dr. Maisch HPLC GmbH)， 3 μm C18粉末 (天津博納艾杰爾科技有限公司)，C18膜 (固相萃取片，3M公司)，二硫蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT，純度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司)，質(zhì)譜級(jí)甲酸 (Formic acid，F(xiàn)A，~98%，SigmaFluka公司)，脫氧膽酸鈉 (Sodium deoxycholate，DOC，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶 (Trypsin Gold，Promega公司)，0.5?20 μL移液吸頭 (T-400，Axygen公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

細(xì)胞裂解液為50 mmol/L碳酸氫銨，體積分?jǐn)?shù)2%的脫氧膽酸鈉，25 mmol/L氯化鈉，pH 8.5。精確稱取一定量的DTT配制成100 mmol/L的DTT溶液，需現(xiàn)用現(xiàn)配。用水作為溶劑配制10 mmol/L的碳酸氫銨 (pH 10)。用水和甲酸配制體積分?jǐn)?shù)為0.1%和1%的FA溶液。利用乙腈和10 mmol/L碳酸氫銨配制乙腈體積分?jǐn)?shù)為6%、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%和35%的反相分離流動(dòng)相。

1.3 293T細(xì)胞樣本制備

新鮮培養(yǎng)的293T細(xì)胞100 μL，加入500 μL細(xì)胞裂解液混勻并超聲。每50 μL裂解產(chǎn)物加入1 μL的100 mmol/L DTT，95 ℃加熱3 min，恢復(fù)室溫后進(jìn)行兩次酶切 (1/50用量，6 h和過夜)。加入150 μL 0.1% FA離心，取上清溶液進(jìn)行真空干燥。自制C18反相分離柱，以T-400移液吸頭為容器，雙層直徑1 mm的C18膜對(duì)吸頭封口，填入耐高pH的3 μm粒徑C18粉末3 mg，利用0.1% FA對(duì)樣品脫鹽，利用反相分離流動(dòng)相洗脫對(duì)酶切產(chǎn)物預(yù)分離，脫鹽及預(yù)分離的餾分真空干燥后保存在–20 ℃，待用。

1.4 大腸桿菌樣本制備

制備過程同1.3。

1.5 色譜方法

色譜柱使用實(shí)驗(yàn)室自制分析柱 (規(guī)格為1.9 μm C18，120 mm×150 μm，80 mm×150 μm)，流動(dòng)相A為水 (含體積分?jǐn)?shù)為0.2%的FA)，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈 (含體積分?jǐn)?shù)為0.2%的FA)。70 min有效梯度：16 min，9%?14% B；36 min，14%?32% B；15 min，32%?40% B；5 min，40%?95% B并持續(xù)5 min。35 min有效梯度：22 min，6%?25% B；12 min，25%?45% B；1 min，45%?95% B并持續(xù)5 min。樣品復(fù)溶溶液為體積分?jǐn)?shù)5%甲醇水溶液 (含體積分?jǐn)?shù)為0.2%的FA)。

1.6 質(zhì)譜方法

質(zhì)譜使用電噴霧離子源 (Electrospray ionization，ESI源)，正離子采集模式，離子傳輸管溫度為320 ℃，噴霧電壓2 000 V。不同檢測(cè)模式下質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

1.7 數(shù)據(jù)處理

DDA采集數(shù)據(jù)利用MaxQuant軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)搜庫，所用蛋白序列數(shù)據(jù)庫來自NCBI網(wǎng)站，更新于2013年7月1日。參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)，母離子質(zhì)量精度10 (Parts per million，ppm)，子離子質(zhì)量精度20 ppm。PRM數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 1.4軟件進(jìn)行搜庫鑒定，母離子質(zhì)量精度：20 ppm，子離子質(zhì)量精度：50 (Milli-mass units，mmu)。利用Skyline軟件進(jìn)行二級(jí)定量抽提。母離子電荷數(shù)目設(shè)定為2和3，質(zhì)量偏差設(shè)定為0.05/。抽提時(shí)間窗口設(shè)定為0.2 min。利用Top 5的碎片離子面積加和代表肽段定量結(jié)果。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)設(shè)置

–Not covered.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱和洗脫梯度條件測(cè)試

首先檢測(cè)了293T全細(xì)胞提取物樣本，在70 min有效梯度內(nèi)，8 cm色譜柱檢測(cè)蛋白數(shù)為4 295，肽段數(shù)為23 709，與12 cm色譜柱的4 455個(gè)蛋白和24 369條肽段相比，基本相當(dāng)。該結(jié)果說明8 cm色譜柱能夠?qū)?fù)雜生物樣品提供足夠的分離能力。同時(shí)短色譜柱能夠承受更高流速，色譜條件可優(yōu)化參數(shù)范圍更廣。

質(zhì)譜檢測(cè)效率與洗脫梯度時(shí)長緊密相關(guān)，縮短洗脫梯度減少了檢測(cè)時(shí)長，但加重肽段共洗脫情況，影響質(zhì)譜檢測(cè)深度。為了權(quán)衡洗脫梯度與檢測(cè)深度，我們利用預(yù)分離的293T樣本，分別用35 min和70 min有效洗脫梯度進(jìn)行深度覆蓋檢測(cè)。結(jié)果表明，前者210 min有效檢測(cè)時(shí)長鑒定到6 916種蛋白和52 760條肽段，與后者420 min有效檢測(cè)時(shí)長的7 126種蛋白和56 563條肽段鑒定結(jié)果相比，蛋白水平無差別，肽段水平有一定程度降低 (圖1A)，這說明色譜梯度縮短并未對(duì)蛋白鑒定深度造成明顯影響，但縮短洗脫梯度后質(zhì)譜檢測(cè)效率在蛋白和肽段水平提升明顯 (圖1B)。綜合上述結(jié)果，縮短色譜柱長和洗脫梯度后，能夠滿足預(yù)分離樣本的分離能力需求，明顯提高質(zhì)譜的檢測(cè)效率。

2.2 洗脫流速測(cè)試

Shishkova等的研究中[24]，常用色譜條件為75 μm內(nèi)徑色譜柱，1.7 μm或1.9 μm粒徑C18填料，柱長10?50 cm，250?350 nL/min的洗脫流速。為了達(dá)到理想分離效果，需使用耐高壓設(shè)備和色譜柱加熱裝置等，增加檢測(cè)平臺(tái)的搭建難度。本研究通過使用150 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管一體柱填充1.9 μm粒徑的C18粉末，填充長度為8 cm，為保證色譜系統(tǒng)在 (低于200 bar) 低壓力條件下即可達(dá)到理想分離效果，我們比較了400、600、800、1 000 nL/min四種流速下293T預(yù)分離后的單一組分樣本檢測(cè)結(jié)果。四種流速下有效梯度時(shí)長無明顯變化，但相對(duì)于1 000 nL/min的流速條件，其他流速條件下肽段保留時(shí)間 (Retention time，RT) 整體依次延后4.7 min、 2.2 min和0.8 min，其中800 nL/min的流速使樣本更好地分布在洗脫梯度中央 (圖2)；4種流速的鑒定結(jié)果在蛋白和肽段水平上無明顯差別 (表2)；鑒定肽段的總離子流 (Total ion current，TIC)，前兩種低流速條件明顯提高 (圖3A)。為了探究TIC變化的原因，我們對(duì)不同流速條件下鑒定肽段進(jìn)行豐度分布統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(e5?e6) 和 (e9?e10) 范圍內(nèi)肽段數(shù)目占總數(shù)的0.6%左右，不影響整體結(jié)果，高流速條件下低豐度肽段 (e6?e7) 數(shù)目明顯增多，而對(duì)于中高豐度肽段 (e7?e8，e8?e9) 數(shù)目減少 (圖3B)。這說明流速的提高對(duì)整體定性結(jié)果無明顯影響，但對(duì)低豐度肽段檢測(cè)的靈敏度有所提高，這是高流速條件的潛在優(yōu)勢(shì)之一。同時(shí)考慮到高流速會(huì)造成系統(tǒng)壓力升高，綜合分析后選用800 nL/min流速。

圖2 不同洗脫流速條件時(shí)色譜峰分布

表2 不同流速下鑒定數(shù)目

2.3 PRM參數(shù)優(yōu)化

PRM檢測(cè)涉及的主要參數(shù)中，掃描分辨率、自動(dòng)增益控制 (Automatic gain control，AGC)、目標(biāo)離子注入時(shí)間、掃描周期時(shí)間以及目標(biāo)肽段時(shí)間窗口都能夠直接影響檢測(cè)效果。通過調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，最終確定了相對(duì)最優(yōu)的PRM檢測(cè)參數(shù) (表1)。

在參數(shù)調(diào)整過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肽段時(shí)間窗口放大，肽段檢測(cè)比例及掃描點(diǎn)數(shù)明顯減少，而時(shí)間窗口大小直接受肽段RT偏移影響。將不同梯度時(shí)長的數(shù)據(jù)進(jìn)行RT偏移分析，利用偏移時(shí)間與相應(yīng)有效梯度時(shí)長之比作為標(biāo)準(zhǔn)化后的偏移率 (圖4)，結(jié)果顯示短梯度 (35 min有效梯度) 相對(duì)于長梯度 (70 min有效梯度) 肽段RT偏移率更低且色譜表現(xiàn)更穩(wěn)定。證明本研究所優(yōu)化后的色譜體系不僅能夠保證色譜分離能力，提高質(zhì)譜的檢測(cè)效率，還能夠?yàn)镻RM靶向定量檢測(cè)提供一個(gè)更加穩(wěn)定的色譜條件，有利于提高PRM的通量。

圖3 不同流速條件下TIC對(duì)比(A) 和肽段豐度分布對(duì)比(B)

圖4 不同色譜條件下RT偏移情況對(duì)比. (A) RT偏移情況(B) 標(biāo)準(zhǔn)化的RT偏移

2.4 PRM檢測(cè)

首先，我們對(duì)293T預(yù)分離樣本采用35 min有效梯度進(jìn)行深度覆蓋檢測(cè)；其次，在深度覆蓋鑒定到的6 870蛋白結(jié)果中，保留擁有2條以上特異性肽段的蛋白，按照蛋白豐度進(jìn)行排序，選取豐度最低的1 000種蛋白作為靶向定量的目標(biāo)蛋白；最后，我們篩選各組分中對(duì)應(yīng)目標(biāo)蛋白的肽段進(jìn)行PRM定量分析。肽段篩選條件包括：無修飾，無漏切，肽段長度8–25個(gè)氨基酸，圖譜評(píng)分 (Ion score) 不低于20，所帶電荷數(shù)目為2或3等條件。各組分最終分別篩選出337、305、283、335、323和330條目的肽段。最終PRM定量結(jié)果中對(duì)目的肽段的鑒定率均在93%以上，個(gè)別組分高達(dá)99%。如果放寬肽段篩選條件，我們?cè)诘?個(gè)組分中共篩選出了501條目標(biāo)肽段，其鑒定率為97%。

隨后對(duì)PRM定量結(jié)果進(jìn)行了評(píng)估，包括對(duì)低豐度肽段定量的準(zhǔn)確性 (定義二級(jí)碎片離子對(duì)應(yīng)點(diǎn)數(shù)大于7為可定量肽段) 與穩(wěn)定性 (重復(fù)檢測(cè)的變異系數(shù)，Coefficient of variation，CV)。碎片離子對(duì)應(yīng)點(diǎn)數(shù)=肽段峰寬 (通過Skyline軟件抽提獲得)/掃描周期時(shí)長 (通過計(jì)算相鄰一級(jí)譜圖時(shí)間之差獲得)。計(jì)算后，掃描周期在1.35 s左右，抽提點(diǎn)數(shù)中位數(shù)在10個(gè)點(diǎn)，CV中位數(shù)在10%以內(nèi) (表3)。說明優(yōu)化過后的PRM檢測(cè)體系能夠在35 min有效梯度內(nèi)對(duì)高達(dá)400條低豐度肽段進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量。

對(duì)150種低豐度目標(biāo)蛋白 (400條肽段)的結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：1) 修飾肽段的檢測(cè)比例42%，遠(yuǎn)低于無修飾肽段的檢測(cè)比例95%，挑選肽段應(yīng)優(yōu)先挑選非修飾肽段；2) 肽段所帶電荷數(shù)目為2 (占比60%) 或3 (占比40%)，檢測(cè)比例無明顯差別；3) 目標(biāo)肽段長度在7?15個(gè)氨基酸 (占比57%)、16?25個(gè)氨基酸 (占比36%) 和26?34個(gè)氨基酸 (占比7%)，三者被檢測(cè)比例相當(dāng)，均為92%，氨基酸序列長短對(duì)檢測(cè)效率無明顯影響；4) 對(duì)全部目標(biāo)肽段的RT分布情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在洗脫時(shí)間內(nèi)肽段分布均勻；5) 在Skyline抽提結(jié)果中，Top 5的碎片離子以y離子居多，占碎片離子總數(shù)的80%左右，這種結(jié)果應(yīng)該與PRM檢測(cè)時(shí)選用高能碰撞破碎 (High-energy collision-induced dissociation，HCD) 模式有關(guān)，最終出現(xiàn)y離子的偏向性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究所優(yōu)化的PRM檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，我們進(jìn)行了倍比稀釋定量實(shí)驗(yàn)。選取293T雙反相預(yù)分離后的單一組分樣本，按照1:3稀釋后用大腸桿菌蛋白作為背景補(bǔ)齊總量。配合實(shí)驗(yàn)室先前研究中所創(chuàng)建的肽段線性情況評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)庫篩選出300條目標(biāo)肽段，覆蓋高中低各豐度蛋白。通過比較DDA和PRM的定量結(jié)果，發(fā)現(xiàn) PRM定量結(jié)果中，定量倍數(shù)結(jié)果以3倍為中心呈正態(tài)分布，且77%的肽段倍數(shù)在2.5?3.5倍之間；而DDA定量結(jié)果中偏離3倍的肽段數(shù)量明顯偏高 (圖5A)。這說明優(yōu)化后的PRM檢測(cè)體系在定量上更加準(zhǔn)確。

表3 293T低豐度蛋白目標(biāo)肽段PRM檢測(cè)結(jié)果

圖5 倍數(shù)稀釋實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)肽段PRM定量結(jié)果 (A：PRM與DDA定量比例分布情況對(duì)比；B：PRM重復(fù)定量CV值)

隨后對(duì)定量肽段的CV值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。300條肽段中95%的肽段CV穩(wěn)定在20%以內(nèi)，且以7%為中心呈正態(tài)分布 (圖5B)。定量穩(wěn)定性的確定，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行CV選取，若肽段豐度高可以選取5%，若豐度極低或通量高，選擇20%的情況也會(huì)存在[25-26]。說明本實(shí)驗(yàn)肽段鑒定穩(wěn)定性在可接受范圍。

綜上所述，本研究通過雙反相高效液相色譜串聯(lián)PRM靶向定量技術(shù)，能夠在35 min有效梯度內(nèi)對(duì)150種低豐度目標(biāo)蛋白 (400條肽段) 進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量，對(duì)于不同豐度的蛋白同樣能夠在單一檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確定量。

3 結(jié)論

通過質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化能夠?qū)崿F(xiàn)PRM檢測(cè)靈敏度的提升，但高復(fù)雜性樣本中共洗脫肽段的干擾是質(zhì)譜靶向定量檢測(cè)時(shí)的主要限制因素，因此PRM技術(shù)需要更加高效穩(wěn)定的色譜系統(tǒng)，這也是該研究的初衷。本研究所創(chuàng)建的雙反相高效液相色譜串聯(lián)PRM靶向定量檢測(cè)系統(tǒng)，通過降低色譜柱柱長、提高液相洗脫流速、縮短色譜洗脫梯度等方法，提高了色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，能夠在35 min有效梯度內(nèi)完成高達(dá)400條低豐度肽段的快速準(zhǔn)確定量。同時(shí)，該系統(tǒng)在相對(duì)較低的液相壓力條件下也具有理想分離效果，避免了耐高壓設(shè)備以及色譜柱加熱裝置等苛刻條件，使檢測(cè)平臺(tái)更易搭建。相信更高效、更精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組靶向定量平臺(tái)的建立，將為進(jìn)一步推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)從基礎(chǔ)研究走向臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Establishment of dual reverse phase chromatography combined parallel reaction monitoring for targeted quantitative proteomics

Kai Li1,2, Lei Song2, Wenhao Shi2, and Xifeng Tian1,3

1 Department of Pathogen Biology, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063009, Hebei, China2 State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences(The PHOENIX center, Beijing), Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China3 Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, Tangshan 063000, Hebei, China

Steady improvement in mass spectrometers technology has transformed the targeted proteome analysis into a new stage. Parallel reaction monitoring (PRM) technology has evolved from the basic multiple reaction monitoring (MRM) targeted proteomics methods in recent years. PRM performs with a higher sensitivity, throughput and reproducibility in targeted quantification, however its limitations in effectiveness and accurate quantification of samples with higher complexity still remain unsolved. In this study through improving the chromatographic conditions of PRM we established a simple and robust platform for targeted proteomic quantification. The newly established PRM system is equipped with columns with increased inner diameter (150 μm) and decreased total length (8 cm); faster liquid phase elution rate (800 nL/min) and shortened elution gradient (35 min). These modifications enable PRM platform to combine with dual reverse phase chromatography, to quantify up to 400 low abundance peptides in human 293T cells whole cell extract. Our findings would benefit the promotion of PRM technology, especially providing a technical option for accurate quantification of low abundance proteins.

dual reverse phase chromatography, parallel reaction monitoring (PRM), targeted quantification

February 8, 2017;

March 28, 2017

Xifeng Tian. Tel: +86-315-8805722; E-mail: tstianxifeng@163.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31471954).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31471954) 資助。