房克鳳

摘要 “熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”是基于北京農(nóng)學(xué)院現(xiàn)有研究生課程的基礎(chǔ)上面擬向農(nóng)業(yè)生產(chǎn)類、生物專業(yè)、動物專業(yè)以及園林專業(yè)的碩士研究生設(shè)置的選修課，其目的在于為研究生進行正式學(xué)術(shù)研究打下一定的實驗技術(shù)基礎(chǔ)。主要講述體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡的原理及應(yīng)用。根據(jù)學(xué)校新修改的研究生課程設(shè)置的精神，進行精講多練?？?7學(xué)時，其中7學(xué)時理論，20學(xué)時實驗。通過本課程的開設(shè)，使得研究生能夠掌握體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡以及激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和使用，為科研工作的順利進行打下堅實的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 熒光顯微術(shù) 課程 教學(xué) 思考

中圖分類號：G424 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.05.074

“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”是一門非常重視實踐性的技術(shù)基礎(chǔ)課?！盁晒怙@微術(shù)原理及應(yīng)用”是基于北京農(nóng)學(xué)院現(xiàn)有研究生課程的基礎(chǔ)上擬向農(nóng)業(yè)生產(chǎn)類、生物專業(yè)、動物專業(yè)以及園林專業(yè)的一年級碩士研究生開設(shè)的公共選修課，希望通過該課程的開設(shè)，為研究生開展學(xué)術(shù)研究奠定一定的實驗技術(shù)基礎(chǔ)。該課程對于研究生掌握科學(xué)研究中的細胞生物學(xué)觀察方法，培養(yǎng)學(xué)生獨立進行科學(xué)研究的素養(yǎng)和能力具有重要作用。作為新開研究生課程，基于北京農(nóng)學(xué)院的實際情況對“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”的教學(xué)與實驗進行了如下設(shè)置及思考。

1“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”課程開設(shè)的必要性

1.1研究手段和技術(shù)的發(fā)展的需要

物質(zhì)吸收電磁輻射后進入激發(fā)態(tài)，而受到激發(fā)的原子或分子在去激發(fā)過程中再發(fā)射波長比激發(fā)光波長更長的光，這種再發(fā)射的光稱為熒光。生物體內(nèi)有些物質(zhì)有自發(fā)熒光，如葉綠素或細胞壁的某些成分，受紫外線照射后發(fā)出熒光；生物體內(nèi)大部分物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但如果用特異性的熒光染料標記后，經(jīng)紫外線或其他波長的光照射后也可以發(fā)出熒光，這種熒光可以被熒光顯微鏡捕獲，并進行定量分析。因此，熒光顯微術(shù)就是基于熒光對這類物質(zhì)進行研究的技術(shù)。熒光顯微鏡依據(jù)觀察物體大小及原理又可以分為多種。常用的有體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡等等。

體視熒光顯微鏡能對微小樣品進行快速、清晰的顯微觀察，并實現(xiàn)完全無漂移的三維立體成像，配有較長的工作距離，不僅能夠獲得較大的景深和光學(xué)細節(jié)，還能保證樣品的真實色彩；對樣品能進行實體測量；具有良好的操控系統(tǒng)，可提供優(yōu)良的重復(fù)性從而使實驗過程簡化。但是體式熒光顯微鏡有缺陷性。其放大倍率較低，適合于研究對象的整體觀察和活體觀察以及一些較大的器官和組織的觀察，不適合觀察小組織或細胞。

與體式熒光顯微鏡相比，熒光顯微鏡放大倍數(shù)較高，工作距離較短。可以觀察更多的細節(jié)。能在組織、細胞和亞細胞的水平上研究細胞內(nèi)物質(zhì)的定位、營養(yǎng)成分的吸收、運輸，以及化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等?？梢赃M行活體或固定材料的觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡是上個世紀80年代發(fā)展起來的一種非常精密的儀器設(shè)備。它以光學(xué)為基礎(chǔ)，將機械、電子、計算機等融為一體。與體式熒光顯微鏡和熒光顯微鏡不同，激光共聚焦以激光為光源，可以把標本分成多個光學(xué)斷層，逐層進行掃描并成像，因此是一種新顯微層面的研究手段。此外，由于激光共聚焦顯微鏡對細胞和組織連續(xù)光學(xué)切片無損傷，而且能夠?qū)铙w細胞進行實時的動態(tài)觀察，使它在生物科學(xué)的研究中占有獨特的地位。目前，人們已廣泛應(yīng)用該技術(shù)來觀察和分析細胞內(nèi)的微細結(jié)構(gòu)和分子在細胞內(nèi)的分布，例如細胞內(nèi)游離鈣、活性氧、轉(zhuǎn)錄因子、表面分子、細胞凋亡、細胞膜流動性、胞內(nèi)分子的運動、細胞間的縫隙連接、蛋白問的相互作用等方面。

傳統(tǒng)的熒光顯微鏡配備的是膠卷相機，膠卷的沖洗非常復(fù)雜、耗時耗力。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字成像系統(tǒng)也應(yīng)用到熒光顯微術(shù)上。其中電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）就是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼攝像產(chǎn)品。它能夠?qū)晒怙@微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)品通過USB接口傳輸?shù)诫娔X中，便于圖像的采集研究。隨著技術(shù)的進一步發(fā)展，分辨率也越來越高，因此通過CCD，可以拍攝到分辨率更高的圖片。

1.2課程設(shè)置的需要

根據(jù)本校研究生現(xiàn)有課程以及科研工作的需要，特開設(shè)“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”。現(xiàn)有的課程“植物顯微技術(shù)”注重石蠟切片，尤其是實驗環(huán)節(jié)甚少涉及顯微鏡；而現(xiàn)有的“電子顯微鏡”課程主要講述超薄切片和透射電鏡以及掃描電鏡的原理及使用。因而“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”課程的開設(shè)，填補了兩者之間的空檔，能夠更好地為廣大教師和研究生的科學(xué)研究工作服務(wù)。

1.3科學(xué)研究的需要

隨著學(xué)校教師科研項目的增多、科學(xué)研究的深入，越來越需要使用相應(yīng)的技術(shù)手段，例如研究特定基因功能，需要進行轉(zhuǎn)基因驗證，一般加入GFP，YFP等報告基因，此時需在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀察將基因表達的蛋白進行定位并分析。

1.4現(xiàn)有實驗平臺的支持

北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室下設(shè)三個研究平臺，其中顯微平臺具備體式熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡和Leiea的激光掃描共聚焦掃描顯微鏡等大型儀器設(shè)備，為本課程的順利開設(shè)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.5教輔人員的配備

開設(shè)本課程的教師具有多年教學(xué)經(jīng)驗以及多年管理體式熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等設(shè)備的經(jīng)驗，為本課程的順利開設(shè)奠定了理論和實踐基礎(chǔ)。

2安排合理的教學(xué)和實驗內(nèi)容

2.1理論與實踐相結(jié)合的教學(xué)理念

熒光顯微術(shù)具有非常強的技術(shù)性和應(yīng)用性，但理論知識的學(xué)習(xí)也是必不可少的。掌握了理論知識，能夠促進實踐應(yīng)用。利用熒光進行顯微觀察的顯微鏡有許多種，根據(jù)本校的設(shè)備基礎(chǔ)結(jié)合教師們的研究需求，重點選擇體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等內(nèi)容。首先，要進行相關(guān)的理論講解，使研究生們掌握理論基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計一些獨立、完整的小實驗，使學(xué)生能夠掌握相應(yīng)儀器的使用方法。例如利用體式熒光顯微鏡進行轉(zhuǎn)基因材料的鑒定。體式熒光顯微鏡具有較大的景深，能夠非常方便地觀察轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因材料，如草莓、番茄、板栗、海棠、百合、玉米等。大大簡化了原來在顯微鏡下觀察的繁瑣的前處理過程。

2.2選擇合適的教學(xué)內(nèi)容

根據(jù)研究生的研究需求結(jié)合學(xué)術(shù)發(fā)展的進展，選擇合適的教學(xué)內(nèi)容。理論課程內(nèi)容主要分為五個部分。第一部分顯微鏡的發(fā)展簡史。包括顯微鏡的發(fā)展，熒光的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展、選擇及使用、熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展和使用等等。第二部分為體式熒光顯微鏡，包括其理論及應(yīng)用。第三部分為熒光顯微鏡，包括理論及應(yīng)用。第四部分為激光掃描共聚焦顯微鏡的理論和應(yīng)用。第五部分：其他熒光顯微技術(shù)，如更為先進的雙光子熒光顯微鏡、轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡等內(nèi)容。

2.3設(shè)置合理的實驗內(nèi)容

教學(xué)中想盡辦法引導(dǎo)學(xué)生把理論知識和其自身的科學(xué)研究有機結(jié)合，提高學(xué)生的興趣和對知識的掌握能力。基于本校農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室顯微平臺的儀器設(shè)備配置情況，結(jié)合研究生研究課題的需求，設(shè)置相應(yīng)的較為系統(tǒng)性的小實驗。

體式熒光顯微鏡因其景深較大，可以觀察較大的實驗材料。例如可以觀察本校不同研究團隊的轉(zhuǎn)基因材料以及較大的組織塊等。前期已經(jīng)成功觀察到了根的轉(zhuǎn)基因熒光。

熒光顯微鏡觀察花粉管內(nèi)囊泡運輸。首先需要選擇合適的花粉。不同物種的花粉其萌發(fā)時間及生長速度差異巨大，要選擇生長速度合適的花粉。首先要培養(yǎng)花粉管，其次用熒光染料FM 4-64標記囊泡，在此過程中需要學(xué)生分組合作，配置所需試劑，隨后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)及花粉管生長情況。接著選擇合適的花粉管，用熒光染料FM 4-64標記囊泡，隨后在熒光顯微鏡下觀察囊泡運輸情況并采集圖像，利用軟件對熒光進行定量分析，得出相應(yīng)結(jié)論，撰寫實驗報告。

利用激光共聚焦顯微鏡采集花粉管內(nèi)游離鈣離子信號。植物細胞因具細胞壁，鈣離子標記較為復(fù)雜，時間較長，能夠鍛煉研究生的動手能力?；ǚ酃芘囵B(yǎng)完畢后用Fluo 4 AM標記鈣離子，用xyt的模式觀察鈣離子的動態(tài)變化，利用軟件進行熒光定量分析，得出相應(yīng)結(jié)論，撰寫實驗報告。

3考核方式的探索

根據(jù)本門課程注重實驗的特點，以及出于對學(xué)生基本實驗技能、創(chuàng)新意識、創(chuàng)造性思維、科學(xué)思想、科學(xué)態(tài)度等進行全面評價，總成績評定由三部分組成：（1）上課及參加實驗的考勤（占30%）；（2）自己制作并進行顯微觀察的圖片質(zhì)量（占40%）；（3）實驗報告寫作及其對實驗中出現(xiàn)問題的分析情況（占30%）。課程論文內(nèi)附有學(xué)生自己拍攝的自己制作的切片的顯微照片，以及對照片出現(xiàn)的問題分析。

4結(jié)語

“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”課程的特點是具有非常強的實踐性，對學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、動手能力及分析問題和解決問題的能力要求較高。因此，為了讓學(xué)生在較短的時間內(nèi)接受嚴格的正規(guī)訓(xùn)練，整個實驗過程讓學(xué)生獨立操作，最后獲取圖片后，對樣品內(nèi)容、樣品質(zhì)量和圖片質(zhì)量進行綜合分析，最后完成實驗報告，能夠較大地提高了研究生進行科學(xué)研究的綜合能力。