王 改 王志華 段紅年 徐 歡 馬江濤 劉鑫惠 劉佳琪 李 寧 常春鵬 郝京霞

保定市兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房1(071051) 河北省兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房2

烏司他丁對過氧化氫誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷的保護(hù)作用

王 改1*王志華1段紅年1徐 歡1馬江濤1劉鑫惠1劉佳琪1李 寧1常春鵬1郝京霞2

保定市兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房1(071051) 河北省兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房2

背景：腸上皮細(xì)胞間緊密連接的破壞及其所致的腸黏膜屏障功能受損在一系列胃腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目的：探討烏司他丁對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷的保護(hù)作用。方法：以Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)制備腸單層上皮屏障模型，將其分為空白對照組(不予干預(yù))、H2O2組(500 μmol/L H2O2)和低濃度(500 U/mL)、高濃度(3 000 U/mL)烏司他丁治療組并予相應(yīng)處理。檢測丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性，以跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)和熒光素鈉透過率評估上皮屏障功能，蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光法檢測緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)和定位，透射電鏡觀察緊密連接超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與空白對照組相比，H2O2組Caco-2細(xì)胞單層上皮MDA水平、熒光素鈉透過率明顯升高，SOD活性、TEER、ZO-1和occludin蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。透射電鏡觀察和免疫熒光法檢測顯示H2O2組細(xì)胞刷狀緣受損，細(xì)胞間連接模糊，ZO-1、occludin蛋白分布斷續(xù)不完整，熒光強(qiáng)度低。烏司他丁治療組上述指標(biāo)均較H2O2組顯著改善(P<0.05)，高濃度組改善更為明顯。結(jié)論：烏司他丁對H2O2誘導(dǎo)的腸單層上皮屏障損傷有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化活性以及調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)和分布有關(guān)。

烏司他丁； 過氧化氫； 腸黏膜屏障； 上皮細(xì)胞； 緊密連接部

腸黏膜屏障是機(jī)體最重要的防御屏障之一，其能選擇性吸收維生素、氨基酸、離子等營養(yǎng)物質(zhì)，并阻止細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)透過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)和其他組織器官。腸黏膜上皮細(xì)胞間完整的緊密連接(tight junction)是腸黏膜屏障的解剖基礎(chǔ)，zonula occludens-1(ZO-1)、claudins、occludin蛋白作為緊密連接的重要組成部分，對于腸黏膜屏障功能的維持至關(guān)重要[1-2]。在各種病理狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，黏膜屏障受損、通透性增加，有害物質(zhì)通過受損腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致敗血癥、膿毒癥甚至多器官功能衰竭[3-5]。烏司他丁(ulinastatin)是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化的一種糖蛋白，可抑制胰蛋白酶等多種胰酶活性，常用于胰腺炎的治療。本研究旨在探討烏司他丁對過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷的保護(hù)作用。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

Caco-2細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)；H2O2、熒光素鈉(Sigma-Aldrich Co. LLC.)；烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù))；兔抗ZO-1多克隆抗體、兔抗occludin多克隆抗體(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)；小鼠抗occludin單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、CY3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(Santa Cruz Biotechnology)；Transwell小室(Corning Costar)；Millcell電阻儀(Merck Millipore)；激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS)；H-7500透射電鏡(日立)。

二、方法

1. 腸單層上皮屏障模型制作和分組：Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell小室中，培養(yǎng)基為含4 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。隔日換液，監(jiān)測跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance, TEER)。細(xì)胞培養(yǎng)21～28 d后TEER明顯增高，證明體外腸單層上皮屏障模型形成。將Caco-2細(xì)胞單層上皮分為4組：空白對照組不予特殊處理；H2O2組與終濃度500 μmol/L H2O2共孵育6 h；低濃度(500 U/mL)和高濃度(3 000 U/mL)烏司他丁治療組予相應(yīng)終濃度烏司他丁和500 μmol/L H2O2共孵育6 h，烏司他丁在H2O2之前30 min給予。烏司他丁高濃度和低濃度治療組具體藥物濃度系參考相關(guān)文獻(xiàn)中烏司他丁干預(yù)其他細(xì)胞(結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞、肥大細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的濃度(50～5 000 U/mL)，選取數(shù)個濃度梯度進(jìn)行預(yù)實驗后根據(jù)實驗結(jié)果確定。每項實驗均選取至少3組非同代細(xì)胞進(jìn)行。

2. MDA、SOD測定：參照試劑盒說明書，分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法測定Caco-2細(xì)胞MDA水平和SOD活性。

3. TEER測定：將Millcell電阻儀的兩個電極分別插入Transwell小室頂側(cè)和基底側(cè)，浸沒于液體中測量Caco-2細(xì)胞單層上皮電阻，整個過程在恒溫37 ℃ 下進(jìn)行。每個小室取不同方向的3個點重復(fù)測定3次。電阻值以Ω/cm2表示。

4. 熒光素鈉透過率測定：于Transwell小室頂側(cè)加入終濃度為67 mg/mL的熒光素鈉，基底側(cè)加入0.6 mL HBSS，37 ℃孵育6 h后收集基底側(cè)液體，熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算熒光素鈉濃度。熒光素鈉透過率(%·h-1·cm-2)=[(基底側(cè)熒光素鈉熒光量/最初加入頂側(cè)的熒光素鈉熒光量)/h]/Transwell有效膜面積×100%[6]。

5. 蛋白質(zhì)印跡法：參照試劑盒說明書提取各組Caco-2細(xì)胞總蛋白，測定蛋白含量。取80 μg蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳；分別加入兔抗ZO-1多克隆 抗體(1∶250)或兔抗occludin多克隆抗體(1∶300)，4 ℃過夜；加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室溫?fù)u動孵育2 h，ECL顯影，凝膠成像分析儀采集圖像，ImageJ軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

6. 免疫熒光法：Caco-2細(xì)胞單層上皮以4%甲醛固定20 min，PBS漂洗，分別加入兔抗ZO-1多克隆 抗體(1∶80)或小鼠抗occludin單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜；漂洗后加入FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶50)或CY3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶250)，室溫孵育1 h，PBS漂洗5 min×3，防淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

7. 透射電鏡檢查：Caco-2細(xì)胞單層上皮以4%戊二醛前固定、1%四氧化鋨后固定2 h，不同濃度丙酮脫水，組織塊置于純丙酮和包埋劑中浸透，包埋，切片，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鋁雙重染色，透射電鏡下拍照。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、烏司他丁對H2O2所致氧化應(yīng)激的影響

與空白對照組相比，H2O2組Caco-2細(xì)胞MDA水平明顯升高，SOD活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。烏司他丁治療組MDA水平較H2O2組顯著降低(P<0.05)，SOD活性較H2O2組顯著升高(P<0.05)，其中高濃度組MDA水平顯著低于低濃度組(P<0.05)，SOD活性與低濃度組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

二、烏司他丁對H2O2誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷的影響

1. TEER：Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)21～28 d時，腸單層上皮屏障TEER為(288.85±26.11) Ω/cm2。H2O2組TEER顯著低于空白對照組(P<0.05)，烏司 他丁治療組TEER較H2O2組顯著增高(P<0.05)，高濃度組較低濃度組增高更為明顯(P<0.05)(表1)。

2. 熒光素鈉透過率：Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)21～28 d時，熒光素鈉透過率為(6.48±1.85)%·h-1·cm-2。H2O2組熒光素鈉透過率顯著高于空白對照組(P<0.05)，烏司他丁治療組熒光素鈉透過率較H2O2組顯著降低(P<0.05)，高濃度組較低濃度組降低更為明顯(P<0.05)(表1)。

3. 緊密連接蛋白表達(dá)和定位：蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，與空白對照組相比，H2O2組ZO-1、occludin蛋白相對表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖1)。透射電鏡觀察顯示，空白對照組Caco-2細(xì)胞刷狀緣完整，排列整齊，細(xì)胞間連接清晰，密度高，H2O2組細(xì)胞刷狀緣受損，排列紊亂，細(xì)胞間連接模糊，密度降低(圖2)，從超微結(jié)構(gòu)角度證實H2O2組腸單層上皮屏障受損、緊密連接破壞。烏司他丁治療組兩種緊密連接蛋白相對表達(dá)量均較H2O2組顯著增高(P<0.05)，高濃度組較低濃度組增高更為明顯(P<0.05)(表1、圖1)。

免疫熒光法檢測顯示，空白對照組ZO-1蛋白沿細(xì)胞膜分布，發(fā)出綠色熒光，呈鋪路石樣連續(xù)完整，熒光強(qiáng)度高；H2O2組ZO-1蛋白分布斷續(xù)不完整，熒光強(qiáng)度低；烏司他丁則可明顯改善H2O2對緊密連接蛋白表達(dá)的抑制作用，使之恢復(fù)至近似空白對照組的狀態(tài)，高濃度組作用更為明顯。Occludin蛋白發(fā)出紅色熒光，在各組中的分布表現(xiàn)和熒光強(qiáng)度同ZO-1蛋白(圖3)。

討 論

腸上皮細(xì)胞間緊密連接是維持腸黏膜屏障功能的解剖基礎(chǔ)，緊密連接破壞及其所致的腸黏膜屏障功能受損在一系列胃腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。各種病理狀態(tài)如嚴(yán)重膿毒癥、敗血癥、急性胰腺炎、急性壞死性小腸炎、輪狀病毒腸炎等均可導(dǎo)致緊密連接破壞和腸黏膜屏障功能受損，致使細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)透過腸黏膜進(jìn)入組織器官和血液循環(huán)， 形成惡性循環(huán)[3-5]。跨膜蛋白o(hù)ccludin是最早被發(fā)現(xiàn)、也是研究最多的緊密連接蛋白，具有4次跨膜結(jié)構(gòu)，形成兩個外環(huán)、 一個內(nèi)環(huán)， 封閉細(xì)胞旁間隙，是緊密連接中的主要功能蛋白[7]。ZO-1分布于細(xì)胞內(nèi)膜表面，連接occludin蛋白與細(xì)胞骨架蛋白，是緊密連接蛋白家族重要的支架蛋白，其表達(dá)和分布的變化可直接影響緊密連接結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響腸黏膜功能[2,6]。兒童腸壁較薄，腸黏膜屏障功能差、通透性高，此特征在兒科疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注，保護(hù)腸黏膜屏障功能成為相關(guān)兒科疾病治療的關(guān)鍵。

表1 各組Caco-2細(xì)胞單層上皮氧化應(yīng)激和上皮屏障功能相關(guān)指標(biāo)比較±s)

圖1 各組Caco-2細(xì)胞單層上皮ZO-1、occludin蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

圖2 空白對照組和H2O2組Caco-2細(xì)胞單層上皮透射電鏡 圖(×30 000)

Caco-2細(xì)胞單層上皮是公認(rèn)的研究上皮細(xì)胞間緊密連接的體外模型[8]。TEER系由離子通過細(xì)胞間隙流動而形成，熒光素鈉透過率體現(xiàn)的是腸單層上皮對小分子的通透性，這兩項指標(biāo)常用于評價腸單層上皮屏障功能。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧的生成超過抗氧化系統(tǒng)防御能力的一種狀態(tài)，H2O2是眾所周知的參與氧化應(yīng)激致細(xì)胞損傷的主要物質(zhì)。研究證實H2O2對腸黏膜屏障功能具有明顯破壞作用，20 μmol/L的濃度即可致Caco-2細(xì)胞單層上皮屏障受損，細(xì)胞旁通透性增加[9]。本研究以500 μmol/L H2O2干預(yù)Caco-2細(xì)胞單層上皮6 h，氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測顯示MDA水平顯著升高，SOD活性顯著降低，上皮屏障功能指標(biāo)TEER顯著降低，熒光素鈉透過率顯著增高，證實H2O2可致氧化應(yīng)激和腸單層上皮屏障功能損傷，與既往研究結(jié)果一致。此外，經(jīng) H2O2干預(yù)的Caco-2細(xì)胞單層上皮緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達(dá)顯著降低，沿細(xì)胞膜分布斷續(xù)不完整，透射電鏡觀察顯示細(xì)胞刷狀緣受損，排列紊亂，細(xì)胞間連接模糊，密度減低。上述發(fā)現(xiàn)提示經(jīng)H2O2干預(yù)后，腸單層上皮屏障細(xì)胞間結(jié)構(gòu)和功能均遭到破壞。

圖3 各組Caco-2細(xì)胞單層上皮ZO-1、occludin蛋白表達(dá)和分布(免疫熒光法，×400)

烏司他丁是從尿液中分離純化的廣譜胰蛋白酶抑制劑，是人體內(nèi)源性抗炎物質(zhì)之一，臨床上廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎、慢性復(fù)發(fā)性胰腺炎的治療[10]，并可作為急性循環(huán)衰竭的搶救輔助用藥。此外，烏司他丁還被嘗試用于治療急性肝衰竭、急性肺損傷等疾病[11-12]。一系列研究表明，烏司他丁具有抗氧化作用，可抑制氧自由基產(chǎn)生，增加SOD活性，亦可抑制多種蛋白水解酶活性，改善機(jī)體微循環(huán)狀態(tài)，穩(wěn)定溶酶體膜，改善Kupffer細(xì)胞功能，抑制多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，保護(hù)腸黏膜屏障以及肝腎、心肺等重要臟器功能[11,13-15]，但國內(nèi)尚未見關(guān)于烏司他丁對緊密連接蛋白影響的報道。本研究結(jié)果顯示，烏司他丁可顯著改善H2O2干預(yù)所致的Caco-2細(xì)胞單層上皮MDA水平升高和SOD活性降低，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，同時反映腸單層上皮屏障功能的TEER、熒光素鈉透過率以及緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達(dá)和分布亦明顯改善，提示烏司他丁對H2O2誘導(dǎo)的腸單層上皮屏障損傷有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化活性以及調(diào)節(jié)緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達(dá)和分布有關(guān)。鑒于本實驗為應(yīng)用腸單層上皮屏障模型的體外研究，其結(jié)果尚需臨床研究加以驗證，以期對臨床腸黏膜屏障保護(hù)的用藥起到一定指導(dǎo)作用。

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(2016-09-09收稿；2016-10-13修回)

Protective Effect of Ulinastatin on Hydrogen Peroxide-induced Intestinal Epithelial Barrier Disruption

WANGGai1,WANGZhihua1,DUANHongnian1,XUHuan1,MAJiangtao1,LIUXinhui1,LIUJiaqi1,LINing1,CHANGChunpeng1,HAOJingxia2.

1DepartmentofPICU,BaodingChildren’sHospital,Baoding,HeibeiProvince(071051);2DepartmentofPICU,Children’sHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang

Background: Disruption of tight junctions between intestinal epithelial cells followed by loss of barrier function is crucial for the pathogenesis and progression of a variety of gastrointestinal disorders. Aims: To investigate the protective effect of ulinastatin on hydrogen peroxide (H2O2)-induced intestinal epithelial barrier disruption. Methods: Model of intestinal epithelial monolayer barrier was established with Caco-2 cellsinvitro, and then divided into four groups: blank control group (without any intervention), H2O2group (500 μmol/L H2O2), low-dose (500 U/mL) and high-dose (3 000 U/mL) ulinastatin groups (ulinastatin + H2O2). Level of malondialdehyde (MDA) and activity of superoxide dismutase (SOD) were detected; transepithelial electrical resistance (TEER) and flux of sodium fluorescein were measured to assess the barrier function; expression and localization of two tight junction proteins, ZO-1 and occludin were evaluated by Western blotting and immunofluorescence; ultrastructure of tight junctions was observed by transmission electron microscopy (TEM). Results: Compared with the blank control group, treatment of Caco-2 cell monolayers with H2O2resulted in increase in level of MDA, flux of sodium fluorescein and decrease in activity of SOD, TEER and expressions of ZO-1 and occludin (Pall <0.05). TEM and immunofluorescence showed that the brusher border of Caco-2 cells in H2O2group was destroyed, the cell-cell junction was vague and the localization of ZO-1 and occludin was discontinuous and the fluorescence intensity was extremely low. While in ulinastatin groups, especially the high-dose group, all the indices above-mentioned were significantly improved (Pall <0.05). Conclusions: Ulinastatin protects intestinal epithelial monolayer barrier against H2O2-induced disruption at least partially by its antioxidant activity and modulating expression and localization of tight junction proteins.

Ulinastatin; Hydrogen Peroxide; Intestinal Mucosal Barrier; Epithelial Cells; Tight Junctions

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.007

*Email: woshiwanggai@163.com