李曉舟

SAS（StatisticalAnalysisSystem）軟件是可完成統(tǒng)計(jì)分析、運(yùn)籌問題等大量模塊的集成軟件系統(tǒng)。借助SAS軟件可方便地定量分析各因素對(duì)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使優(yōu)化后的工藝科學(xué)性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、可信度高。其中Plackett-Burman設(shè)計(jì)法（諸因素內(nèi)重要因子的篩選方法）采用兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用最少的試驗(yàn)次數(shù)盡可能精確估計(jì)因素中的主效果，可在眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素?？蛇x擇可信度大于90%（或85%）的因素作為重要因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)，與目前常用的部分因子實(shí)驗(yàn)和隨機(jī)平衡實(shí)驗(yàn)相比，該方法最為高效、準(zhǔn)確。根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果，從眾因素中篩選出重要因子，以原濃度為基礎(chǔ)，以一定濃度為梯度進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，從而確定重要因子的濃度范圍。響應(yīng)面分析法（RSA）是綜合試驗(yàn)分析和數(shù)學(xué)建模最經(jīng)濟(jì)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法。彌補(bǔ)了以前在微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方面的不足，是近年來應(yīng)用最多的一種優(yōu)化技術(shù)。Placket-Burman法和響應(yīng)面分析法已被成功地運(yùn)用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化研究中。Konyaetal（1998）采用RSA和最速增長(zhǎng)途徑法來研究培養(yǎng)基最佳濃度，提高康帕汀產(chǎn)率62%，而工作量比常規(guī)實(shí)驗(yàn)減少40%左右。Ismail（1999）、張麗霞（2006）、曹小紅（2007）、周波（2008）、牛芳方（2009）等在研究發(fā)酵生產(chǎn)中成功地應(yīng)用了Plackett-Burman設(shè)計(jì)法及RSA，高效快速地獲得了優(yōu)化工藝。

本研究的目的是通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，提高發(fā)酵液中的菌體數(shù)量和芽孢含量，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisBS35。

1.2 液體種子液制備

BS35經(jīng)過LB平板活化后，挑取單菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于29℃、140rpm培養(yǎng)16h。

1.3 培養(yǎng)基

參照劉林、張麗霞（2006）枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方

1號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉49.5g，玉米粉25.3g，酵母浸粉，K2HPO41.1g，MgSO40.1g，CaCl20.1g，MnSO41.5g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

2號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉3g，黃豆粉3g，葡萄糖0.5g，MnSO42g，K2HPO43g，KH2PO41.5g蒸餾水1000ml，pH8.0；

3號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉1.0g，黃豆粉30.0g，MnSO41.0g，K2HPO43g，KH2PO41.5g，葡萄糖15.0g，硫酸鎂0.5g，酵母浸粉0.2g，氯化鐵0.1g，碳酸鈣0.1g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

4號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50.0g，黃豆粉30.0g，酵母浸粉10.0g，碳酸鈣7.0g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

5號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10.0g，葡萄糖5.0g，黃豆粉15.0g，碳酸鈣5.0g，硫酸胺1.0g，磷酸氫二鉀0.3g，硫酸鎂·7H2O，硫酸錳·H2O0.2g蒸餾水1000ml，pH8.0；

6號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉3.0g，葡萄糖3.0g，黃豆粉3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，MgSO4.7H2O0.4g，硫酸亞鐵0.02g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

7號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，玉米粉20.0g，黃豆粉15.0g，硫酸錳0.1g，硫酸鎂0.1g，碳酸鈣2.0g，酵母浸粉3.0g，硫酸亞鐵0.02g，磷酸氫二鉀2.0g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

8號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5.0g，葡萄糖3.0g，豆餅粉5.0g，魚粉3.0g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

9號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉46.0g，豆餅粉35.0g，葡萄糖1.0g，K2HPO43.2g，MgSO4·7H2O0.1g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

10號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10.0g，葡萄糖5.0g，豆餅粉15.0g，魚粉5.0g，CaCO35.0g，（NH4）2SO41.0g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.2g，蒸餾水1000ml，pH8.0；

1.4芽孢染色法

芽孢染色：孔雀綠染色法，按革蘭氏染色涂片后，加孔雀綠染色液3-4滴，用木莢夾住載玻片，在火焰上加熱，使有蒸汽產(chǎn)生，但勿使沸騰，如此反復(fù)染色10min。在染色中，依據(jù)蒸發(fā)情況隨時(shí)添加染色液或水，使涂面上保持不干。用清水沖洗約半分鐘，至無多余染色液流下為止。用2%番紅染色3min，水洗，晾干。鏡檢。芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

1.5含菌量測(cè)定

將已培養(yǎng)42h的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取100μl在LB平板培養(yǎng)基上涂板，24h后記錄菌落數(shù)量，計(jì)算cfu/ml。

1.6芽孢形成率

以染色后顯微鏡下觀察計(jì)算，一個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞中芽孢的數(shù)量。芽孢形成率=（芽孢的數(shù)量/100）×100%

1.7發(fā)酵條件

250ml三角瓶中按100ml培養(yǎng)基的裝液量，調(diào)其初始pH值到8.0，以6%的接菌量接種子培養(yǎng)液，于29℃、140rpm振蕩培養(yǎng)。

1.8培養(yǎng)基配方優(yōu)化設(shè)計(jì)方案

通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)初始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各種成份的影響效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出有顯著影響效應(yīng)的因素，然后利用最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)逼近重要因素的最適濃度范圍，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)，再通過響應(yīng)分析法（ResponseSurfaceAnalysis，RSA）確定最佳發(fā)酵配方，最后進(jìn)行模型驗(yàn)證。

1.8.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選培養(yǎng)基中重要因子：應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法全面考察初始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液中6個(gè)成分的影響效應(yīng)，篩選培養(yǎng)基中影響發(fā)酵液含菌量的重要因子。在SAS軟件中調(diào)出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表格，各因子設(shè)置高低兩水平，低水平為初始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基各成分的濃度，高水平為低水平的1.5倍。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素及水平列表（g/L）

1.8.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)接近最大響應(yīng)面區(qū)域：由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)回歸分析確定重要因素，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出各因素的t值和可信度，一般選擇可信度大于90%或85%以上的因素作為重要因素，并根據(jù)這些因素對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的正影響（T值為正）或負(fù)影響（T值為負(fù)）設(shè)計(jì)最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)，增加或減少重要因素在培養(yǎng)基中的濃度，其余因素均取低水平即初始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液的濃度，考察發(fā)酵液中菌體數(shù)的變化趨勢(shì)，確定重要因素的最適濃度范圍。

1.8.3響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要因素的最優(yōu)濃度水平：根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定了影響芽孢形成數(shù)量的重要因素，再以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定接近響應(yīng)值區(qū)域的重要因素的濃度，運(yùn)用Box-Behnken法進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，確定重要因素的水平。