黃漩，王俊平，2，王俊英，劉翠翠，王碩，*（.天津科技大學，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津00457；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱5000；.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京0008）

MALDI-TOF質譜法分析與鑒定羊乳中的磷酸肽

黃漩1，王俊平1，2，王俊英3，劉翠翠1，王碩1，*
（1.天津科技大學，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津300457；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱150030；3.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081）

基于基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）技術建立一種羊乳中磷酸化肽段的檢測方法。以商品化二氧化鈦（TiO2）為富集材料用于羊乳中低豐度磷酸肽的富集，并優(yōu)化了商品化TiO2富集羊乳中磷酸肽的最佳吸附洗脫條件，得到的結果為，孵育緩沖液為乙腈∶水（50∶50，體積比）+1%三氟乙酸，洗脫液為氨水15%。接著探討了脫脂對檢測結果的影響，結果表明，通過MALDI-TOF MS分析實際乳磷酸肽時，需要對乳類樣品進行脫脂才能更完整的鑒定磷酸肽，從羊乳中鑒定出八個磷酸化肽段通過Mascot數(shù)據(jù)庫檢索。本研究為乳類磷酸肽指紋圖譜的建立提供了理論基礎，指紋圖譜的建立能夠應用于摻假乳的快速鑒定。

MALDI-TOF MS；富集；羊乳；磷酸化肽段

羊乳在國際上有“奶中之王”的美譽。南朝時期醫(yī)學家陶弘景[1]說：“羊乳實為補腎，故北人食之多肥健”。羊乳的消化性要強于牛乳，有利于人體吸收，羊乳脂肪顆粒體積的大小僅為牛乳的三分之一。羊乳中的蛋白質、礦物質、VA和VB的含量都比牛乳高，尤其是磷和鈣，這些特性對保護視力、快速恢復體能具有明顯作用。專家建議嬰幼兒、身體虛弱，患有支氣管炎、過敏癥或胃腸疾病的人群食用羊乳。在歐洲，鮮羊乳的市場需求遠遠高于鮮牛乳。隨著對羊乳營養(yǎng)價值近一步的認識，在我國一些大中城市，羊乳逐漸被人們視為日常生活中的營養(yǎng)保健佳品[2]。隨著羊乳市場的擴大，一些不法商販在羊乳中摻雜較便宜的牛乳成份欺騙消費者[3]。針對這種現(xiàn)象，通過羊乳與牛乳成分組成的差別，建立了多種鑒定楊乳摻假的方法。

酪蛋白是乳中的主要蛋白質，主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。不同哺乳動物乳類的酪蛋白存在一定的差別，這些差別造成不同哺乳動物乳的營養(yǎng)特性及其功能特性[4]。牛乳以α-酪蛋白為主，人乳不含αs1-酪蛋白，羊乳含較少的αs1-酪蛋白和大量的β-酪蛋白，所以羊乳比牛乳更接近人乳[5]。酪蛋白磷酸肽（CPPs）是一種典型的富磷蛋白多肽，它來源于酪蛋白的酶解產(chǎn)物[6]。CPPs且具有防止光褪色、免疫調節(jié)[7]、防齲齒[8]，提高礦物質的生物利用率，促進鈣[9-10]、鋅、鐵[11-12]的吸收等作用。從乳制品中能夠直接分離提取CPPs，作為天然的、無毒害的多肽類食品添加劑應用于不同的食品中，具有較高的安全性[13]。在不同哺乳動物的乳中，CPPs種類和含量各有不同，使其發(fā)揮的作用不同，所以分析不同乳類的CPPs并研究其生理功能是功能性食品的一個重要方向。且通過不同乳類CPPs的鑒定，獲得一個全面的CPPs質譜圖譜信息為鑒別乳摻假提供了理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1，4-二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶美國：Sigma公司；尿素：上海生工生物有限公司；三氟乙酸：美國Alfa Aesar公司；2，5-二羥基苯甲酸（DHB）：德國Bruker公司；碳酸氫銨：天津博迪化工股份有限公司；乙腈、氨水：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸：博歐特（天津）化工貿易有限公司；羊乳：陜味之美（陜西）。

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；Centrifuge 5804R臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；HH-S1恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；UltrafleXtremeTM基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）、MTP 384不銹鋼靶板：德國Bruker公司。

1.2方法

1.2.1羊乳酶解液的制備

0.25mL羊乳（蛋白質：3.5 mg/100 mg）與0.25 mL尿素（8 mol，50 mmol NH4HCO3）渦旋混合，在室溫下變性2.5 h。20μL DTT（10 mmol，50 mmol NH4HCO3）加入到變性溶液中，繼續(xù)振蕩2 h在37℃水浴搖床中。在避光下，加入20μL IAA（20 mmol，50 mmol NH4HCO3）使樣品烷基化，常溫振蕩30 min。用碳酸氫銨緩沖溶液（50 mmol）使烷基化的樣品稀釋10倍，防止高濃度的尿素破壞胰蛋白酶活性，最后加入230μL胰蛋白酶溶液（1 mg/mL），37℃水浴搖床酶解16 h，將酶解后得到的產(chǎn)物分裝后冷凍保藏，備用。

1.2.2磷酸化肽段的富集

稱取2.0 mg商品化TiO2材料先通過吸附緩沖液潤洗，離心分離（5 000 r/min，5 min），棄去上清。材料潤洗后與稀釋至一定濃度的磷酸肽酶解液（孵育緩沖溶液稀釋）混合，使用移液槍反復吸打，渦旋振蕩，充分混合材料與磷酸化肽段，吸附30 min，離心分離（5 000 r/min，5 min），用孵育溶液清洗吸附磷酸肽的材料3遍，通過一定濃度的氨水（200μL）洗脫材料上吸附的磷酸肽，吸附磷酸肽的材料與氨水充分混合（吸打、渦旋），洗脫30 min，離心分離（5 000 r/min，5 min），上清液在去離子水中透析1 h（透析袋：截留分子量500～1 000），用MALDI-TOF分析檢測得到的溶液。

1.2.3MALDI-TOF MS分析

在正離子反射模式下進行，通過UltrafleXtremeTM飛行時間質譜（布魯克公司）檢測分析富集的磷酸化肽段，該質譜配備有延遲萃取裝置和波長為337 nm的脈沖氮氣激光，激光頻率2 000 Hz，加速電壓25 kV，單次掃描信號累加1 000次，靶板為MTP 384不銹鋼靶板，用0.1%TFA水溶液稀釋富集的酶解肽段到適當?shù)臐舛龋?μL酶解肽段稀釋液與2μL DHB基質（20 mg/mL，30%ACN，1%H3PO4）混和，取1μL混合液點在靶板上用于MALDI-TOF MS分析。

磷酸化肽段信息通過MASCOT（http：//www.matrixscience.com/）用數(shù)據(jù)庫檢索。數(shù)據(jù)庫：SwissProt；分類學：Mammalia（mammals）；質量容忍度：100 ppm；固定修飾：Carbamidomethyl（C）；可能修飾：氧化（M），磷酸化（ST）。

2　結果

不同材料與目標物的最佳吸附、洗脫條件會存在一定的差異，TiO2雖然對磷酸肽具有超強的吸附性能，但在一定的條件下，對非磷酸肽也會表現(xiàn)出較強的親和性，所以優(yōu)化TiO2材料在羊乳磷酸肽富集中的吸附、洗脫條件是必要的。

2.1三氟乙酸含量對磷酸肽富集的影響

磷酸肽因磷酸基團的存在具有親水性的特點，而非磷酸肽段則表現(xiàn)為疏水性，在孵育緩沖液中添加適量的乙腈能夠降低金屬氧化物與疏水性非磷酸肽間非特異性吸附作用，從而減少非磷酸肽的干擾。TiO2是兩性金屬氧化物，酸性條件結合磷酸肽，堿性條件釋放出磷酸肽，pH值為3.5～4.5的酸性氨基酸會對材料富集磷酸肽造成干擾，以0.1%，0.5%和1%3個TFA的添加量試驗TiO2富集材料結合磷酸肽的最適pH。未經(jīng)過富集處理的羊乳酶切肽段如圖1-A所示，結果表明未經(jīng)過富集無法觀察到磷酸肽，非磷酸肽主導整個質譜圖。TFA的添加量為0.1%對磷酸肽富集的影響如圖1-B所示，只能檢測到β（17～43）磷酸化肽段及其中性丟失分子，基線漂移。TFA的添加量為0.5%對磷酸肽富集的影響如圖1-C所示，能夠檢測到7個磷酸化肽段，基本沒有非磷酸肽的干擾。TFA的添加量為1.0%對磷酸肽富集的影響如圖1-D所示，從圖中可以觀察到8個磷酸化肽段及其中性丟失峰，且信號明顯要高于TFA含量為0.5%的洗脫液。因此，我們把1.0%TFA添加到乙腈和水的混合液（ACN∶H2O= 50∶50，體積比）中，作為最佳條件的孵育緩沖溶液用于磷酸肽的富集。

2.2洗脫液中氨水含量對磷酸肽富集的影響

MALDI-TOF MS分析前，需要用適合的洗脫液最大限度的把富集到材料上的磷酸肽洗脫下來。在堿性條件下，金屬氧化物TiO2顯示出路易斯堿的性質，能夠釋放材料上富集的磷酸肽，金屬氧化物富集的磷酸肽洗脫時需要在堿性條件下進行。在部分試驗中，以5%、10%和15%3個氨水的濃度考察最佳洗脫條件。5%NH3·H2O作為洗脫液對磷酸肽富集的影響如圖2-A所示，無法檢測到磷酸肽，氨水含量太低，無法從材料上將磷酸肽洗脫下來，洗脫下來的肽段都是非磷酸肽。氨水的含量上升至10%對磷酸肽富集的影響如圖2-B所示，能夠檢測到全部磷酸肽及其中性丟失片段，基本沒有非磷酸肽干擾，但是響應強度不及氨水含量為15%的洗脫液，15%NH3·H2O作為洗脫液對磷酸肽富集的影響如圖2-C所示，8種磷酸肽不但都檢測出來，而且信號強度很高。所以15%NH3·H2O作為最佳的洗脫液，15%NH3·H2O的pH值大概在11左右，金屬化合物及磷酸肽之間的吸附強度降至最小，能洗脫下大量的磷酸肽。

圖1　羊乳酶解液（A）未經(jīng)過富集；孵育緩沖液中TFA含量分別為（B）0.1%，（C）0.5%，（D）1.0%的MALDI-TOF MS質譜圖Fig.1　MALDI-TOF MS spectra oftryptic goatmilk digest（A）without enrichment；after enrichmentby commercial TiO2using TFA in incubation with differentcontentsof（B）0.1%，（C）0.5%，and（D）1.0%

圖2　羊乳酶解液通過商品化TiO2富集后，洗脫液中氨水含量分別為（A）5%，（B）10%，（C）15%的MALDI-TOF MS質譜圖Fig.2　MALDI-TOF MS spectra oftryptic goat milk digest after enrichmentby TiO2using NH3·H2O in eluentwith differentcontents of（A）5%，（B）10%，（C）15%

2.3脫脂對羊乳磷酸肽檢測的影響

常用于磷酸肽檢測的樣品是牛乳，且大多數(shù)文獻中要求所用的牛乳為脫脂牛乳，但是除了牛乳的其他乳類樣品多數(shù)沒有脫脂產(chǎn)品，這為磷酸肽的檢測造成了困難，所以在這部分試驗中，我們測定脫脂羊乳與未脫脂羊乳之間磷酸肽的差異。通過高速離心機沉淀脂肪，取上清液再離心兩次，得到脫脂羊乳。未脫脂羊乳的質譜圖如圖3-A所示，能夠檢測到7種磷酸肽，只是αs1（130～139）這個磷酸肽豐度較弱，甚至未檢測出αS2（142～153）。脫脂羊乳的質譜圖如圖3-B所示，我們可以看出8種羊乳磷酸肽都以較好的強度被測定出來。說明未經(jīng)過脫脂處理的樣品雖然能夠用于磷酸肽的檢測，但是對檢測靈敏度存在一定的影響。所以在進行乳類磷酸肽測定前，應該先進性脫脂處理。

圖3?。ˋ）全脂羊乳，（B）脫脂羊乳酶切肽段被商業(yè)化TiO2富集后的質譜圖Fig.3　MALDI-TOF/MS spectra of tryptic（A）whole goatmilk，and（B）non-fatgoatmilk digests enriched by commercialTiO2

磷酸化肽段的詳細信息見表1。

表1　通過MALDI-TOF-TOF MS分析的羊乳酶解液中的磷酸肽Table 1　The phosphopeptides from tryptic goat milk digest wereidentified by MALDI-TOF-TOF MS analysis

3　結論

本工作是以羊乳為研究對象，通過TiO2材料對其中的磷酸肽進行富集，分別從孵育緩沖液中的TFA含量及洗脫液中氨水含量兩個個方面對材料的富集條件進行優(yōu)化，通過MALDI-TOF MS結果分析出最適合的孵育緩沖液為乙腈∶水（體積比50∶50，1%TFA），洗脫液為15%NH3·H2O，在優(yōu)化條件下，對比脫脂處理對檢測乳類磷酸肽的重要性，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出8個磷酸化肽段。該方法簡單快速，能夠應用于不同乳制品中磷酸肽的檢測，同時對羊乳蛋白質組學分析具有重要的參考意義，同時也為加工羊乳相關的功能性食品奠定了理論基礎。

[1]陳騰山,徐世常．乳品市場新寵羊乳[J]．牧業(yè)觀察,2008(1):102

[2]張小苗．羊乳和牛乳理化特性比較及其摻假檢測研究[D]．西安:陜西科技大學,2012

[3]THRESA G．Detection of Bovine Milk in Ovine Milk by an Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assy[J]．J Dairy Sci,1990,73(6): 1 489-1 493

[4]李龍柱,張富新,賈潤芳,等．不同哺乳動物乳中主要營養(yǎng)成分比較的研究進展[J]．食品工業(yè)科技,2012,33(19):396-400

[5]CLARK S,SHERBON JW．Genetic variants ofalpha(s1)-CN in goat milk:breed distribution and associations with milk composition and coagulation properties[J]．Small Rumin Res,2000,38(2):135-143

[6]Kappeler S．Compositional and structural analysis of camel milk proteins with emphasis on protective proteins[D]．Swiss:Eidgen觟ssische Technische Hochschule Zürich,1998

[7]汪家琦．金屬氧化物磁材料制備及其純化酪蛋白磷酸肽的研究[D]．無錫:江南大學,2014

[8]Beg OU,Von Bahr-Lindstrom H,Zaidi ZH,et al．A camel milk whey protein rich in half-cystine[J]．European Journal of Biochemistry, 1986,159(1):195-201

[9]Farah Z,Streiff T,Bachmann MR．Manufacture and characterization ofcamelmilk buffer[J].Milchwissenschaft,1989,44(7):412-414

[10]Sawaya WN,Khalil JK,Al-Shalhat A,et al．Chemical Composition And Nutritional Quality of Camel Milk[J]．Journal of Food Science, 2006,49(3):744-747

[11]Kappeler S．Compositional and structural analysis of camel milk proteins with emphasis on protective proteins[D]．Swiss:Eidgen觟ssische Technische Hochschule Zürich,1998

[12]Omar AA,Hamad AAK．Compositional,technological and nutritional aspects ofdromedary camelmilk[J]．InternationalDairy Journal,2010, 20(12):811-821

[13]Tsuchita H,Sekiguchi I,Kuwata T,etal．The effectofcasein phosphopeptides on calcium utilization in young ovariectomized rats[J]．Zeitschrift Für Ernahrungswissenschaft,1993,32(2):121-130

Analysis and Identification of the Phosphopeptides in Goat Milk by MALDI-TOF MS

HUANG Xuan1，WANG Jun-ping1，2，WANG Jun-ying3，LIU Cui-cui1，WANG Shuo1，*
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，NortheastAgricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；3.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of AgriculturalSciences，Beijing 100081，China）

A novel determination method was developed for the phosphopeptide of goat milk which based on MALDI-TOF MS technology.Primarily，commercial TiO2was recommended for the process of phosphopeptide enrichment，and the optimized resultofenrichmentprocess suggests thatthe content ofphosphopeptide reached a maximum by using acetonitrile∶water（50∶50，volume ratio）+1%trifluoroacetic acid as the incubation buffer while using 15%ammonia as eluent.Subsequently，the effect of remove fat from milk for the detection resultwas discussed，and the resultItconfirmed thatitis necessary to remove fat from milk before make a more complete identification ofthe phosphopeptides in milk samples.MALDI-TOF MS was used to determine the enriched phosphopeptide of goat milk.Through fingerprints analysis and comparison with the Mascot database，eight phosphopeptides have been identified in goatmilk.The present study provides the theory base for the establishmentofthe dairy phosphopeptide fingerprintand contributes for rapid identification ofadulterated milk.

MALDI-TOF MS；enrichment；goatmilk；phosphopeptides

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.028

國家“863”高新技術項目（2012AA101604）；轉基因重大專項（2014ZX08012-001）

黃漩（1986—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品安全檢測。

2015-10-20