閆春生

(黃河科技學(xué)院，河南　鄭州　450063)

川芎嗪聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對急性腦梗死模型大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞與突觸和運(yùn)動功能的影響

閆春生

(黃河科技學(xué)院，河南鄭州450063)

〔摘要〕目的探討川芎嗪聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對急性腦梗死大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、突觸、運(yùn)功功能的影響。方法將120只成功造模急性腦梗死大鼠隨機(jī)分為空白組、運(yùn)動訓(xùn)練組(運(yùn)動組)、川芎嗪注射組(川芎嗪組)和川芎嗪聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練組(聯(lián)合組)。于術(shù)后1、3、6 w采用顯微電鏡觀察法計(jì)數(shù)四組大鼠病灶周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)量；采用免疫組化法測定四組大鼠病灶周圍膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、生長相關(guān)蛋白(GAP)-43和突觸素的含量；采用橫木行走試驗(yàn)評價(jià)四組大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)狀況。結(jié)果運(yùn)動組、川芎嗪組和聯(lián)合組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)量均逐步增加，且均多于同時(shí)間點(diǎn)的空白組，但聯(lián)合組的數(shù)量明顯多于另外兩組(P<0.05)；運(yùn)動組、川芎嗪組和聯(lián)合組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)GFAP、GAP-43和突觸素的含量均高于同時(shí)間點(diǎn)的空白組，但聯(lián)合組的含量明顯多于另外兩組(P<0.05)；運(yùn)動組、川芎嗪組和聯(lián)合組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動功能評價(jià)得分均逐步上升，且均多于同時(shí)間點(diǎn)的空白組，但聯(lián)合組的得分明顯高于另外兩組(P<0.05)。結(jié)論采用川芎嗪聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對急性腦梗死大鼠進(jìn)行治療，可以幫助促進(jìn)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的增加和運(yùn)動功能的恢復(fù)，且其效果好于進(jìn)行單純運(yùn)動訓(xùn)練和川芎嗪注射治療的大鼠。

〔關(guān)鍵詞〕川芎嗪;運(yùn)動訓(xùn)練;急性腦梗死;星形膠質(zhì)細(xì)胞

星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生對于腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要〔1〕。雖然目前對于這種損傷修復(fù)反應(yīng)的觸發(fā)機(jī)制尚不明確，但是可以通過監(jiān)測病灶附近星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的數(shù)目大致推斷腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)狀況〔2〕。目前公認(rèn)的對于腦組織功能恢復(fù)有積極作用的是運(yùn)動訓(xùn)練，中藥川芎嗪有改善腦部血液微循環(huán)、活血化瘀的功效〔3〕。本研究旨在探討川芎嗪聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練對急性腦梗死大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、突觸、運(yùn)功功能的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物選擇一級雄性SD大鼠240只，月齡2.5～4個(gè)月，體重為(200±20)g，由江蘇南京青龍場實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心提供。所有大鼠在研究期間均飼養(yǎng)于20℃～25℃條件下，給予普通顆粒飼料和自來水。本研究首先造成大鼠腎性高血壓模型，造模成功每周檢測大鼠血壓，直到10 w后，大鼠血壓基本穩(wěn)定在(190±5)mmHg時(shí)，制作急性腦梗死大鼠模型。采用線栓法造成大鼠右側(cè)大腦中間動脈閉塞。大鼠急性腦梗死造模成功的標(biāo)志為大鼠在麻醉蘇醒后24 h內(nèi)出現(xiàn)以下癥狀〔4〕：①身體向左傾倒或向左轉(zhuǎn)圈；②左側(cè)軀體對疼痛刺激無反應(yīng)；③提尾懸空時(shí)左前肢前伸現(xiàn)象消失。判定為造模成功。對于由于各種因素出現(xiàn)的造模失敗造成試驗(yàn)動物數(shù)量不足時(shí)，通過隨機(jī)抽樣造模補(bǔ)齊。依據(jù)隨機(jī)分組原則，將240只造模成功的大鼠分為空白對照組(空白組)、運(yùn)動訓(xùn)練組(運(yùn)動組)、川芎嗪注射組(川芎嗪組)和川芎嗪聯(lián)合運(yùn)動訓(xùn)練組(聯(lián)合組)，每組60只。四組大鼠造模前血壓、月齡、體重等基本資料均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有可比性。于造模后1、3和6 w 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每次取20只大鼠，觀察其相應(yīng)生理指標(biāo)和運(yùn)動功能。

1.2儀器與試劑儀器：飛納高分別率專業(yè)電鏡，復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司；動態(tài)顆粒圖像分析儀，德國新帕泰克有限公司。試劑：注射用磷酸川芎嗪，化學(xué)藥品，50 mg，海南雙成藥業(yè)股份有限公司；戊巴比妥鈉，化學(xué)藥品，5 g，北京普博斯生物；多聚甲醛，化學(xué)試劑，500 g，鄭州億之中化工產(chǎn)品有限公司；抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單抗、抗生長相關(guān)蛋白(GAP)-43單抗、兔抗人突觸素抗體，北京中杉生物技術(shù)有效公司。

1.3運(yùn)動訓(xùn)練和給藥方式

1.3.1運(yùn)動訓(xùn)練方式運(yùn)動組和聯(lián)合組大鼠每天進(jìn)行行走、旋轉(zhuǎn)和抓握力訓(xùn)練各10 min，1次/d。行走訓(xùn)練采用自制的150 cm長，2 cm寬，距地面10 cm的木板，將大鼠置于其上行走；旋轉(zhuǎn)訓(xùn)練采用自制的100 cm長，30 cm半徑的網(wǎng)狀滾筒式訓(xùn)練器，該訓(xùn)練器被均分為4格，每次可以訓(xùn)練4只大鼠，訓(xùn)練器內(nèi)置馬達(dá)，訓(xùn)練時(shí)設(shè)置為5 r/min；抓握力訓(xùn)練采用1 cm×1 cm大小網(wǎng)格的網(wǎng)帶，將大鼠置于其上后，突然將其垂立，每次保持10 s，注意觀察大鼠是否會掉落。

1.3.2給藥方式川芎嗪組和聯(lián)合組大鼠接受川芎嗪注射液尾靜脈注射。與造模成功24 h后，尾靜脈注射川芎嗪葡萄糖溶液，劑量為9.6 mg/kg，1次/d，以2 w為1個(gè)療程。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1顯微電鏡觀察四組大鼠在造模成功后1、3、6 w分別取10只大鼠制作其腦組織冠狀切片，每片厚度為2 mm，從包含梗死病灶的切片上取下病灶附近的腦組織1 mm3，將其按照標(biāo)準(zhǔn)步驟固定、染色，而后置于顯微電鏡下觀察8 000倍視野下的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)量，選擇20個(gè)視野計(jì)算神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的平均數(shù)量。

1.4.2免疫組化研究四組大鼠在造模成功后1、3和6 w分別取10只大鼠測定其病灶附近腦組織中GFAP、GAP-43和突觸素的含量：先經(jīng)腹腔注射1%的戊巴比妥鈉，而后經(jīng)升主動脈插管后前后注入100 ml生理鹽水和4%多聚甲醛。2 h后，取腦，制成5 μm的3套連續(xù)的貼膠切片。分別使用抗GFAP、GAP-43單抗和兔抗人突觸素抗體對3套切片進(jìn)行染色。在梗死病灶附近隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用圖像分析系統(tǒng)檢測免疫反應(yīng)產(chǎn)物的信號密度值，以此來代表相應(yīng)蛋白的含量。

1.4.3橫木行走試驗(yàn)采用自制的150 cm長、2 cm寬、距地面10 cm的木板，將大鼠置于其上行走，木板一端給予強(qiáng)光照射和噪音刺激，另一端給予黑鼠籠。評分以患肢在行走中所起作用大小為依據(jù)，患肢起到0%的作用計(jì)1分，起到10%作用計(jì)2分，……，起到50%作用計(jì)6分，起到50%以上的作用計(jì)7分。評分由三人同時(shí)進(jìn)行，取平均分，評分三人均不知大鼠分組情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1顯微電鏡觀察結(jié)果四組大鼠隨時(shí)間推移星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)量都有所增加，但是運(yùn)動組、川芎嗪組和聯(lián)合組星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)量增加的量都顯著大于空白組(P<0.05)，其中聯(lián)合組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)量增加的最為明顯(P<0.05)。見表1。

表1　四組大鼠顯微電鏡觀察結(jié)果,個(gè)/8 000倍視野，n=10)

與空白組比較：1)P<0.05；與運(yùn)動組比較：2)P<0.05；與川芎嗪組比較：3)P<0.05；下表同

2.2橫木行走試驗(yàn)結(jié)果四組大鼠隨時(shí)間推移運(yùn)動功能都有所恢復(fù)，但是運(yùn)動組、川嗪組和聯(lián)合組3種蛋白運(yùn)動功能得分顯著高于空白組(P<0.05)，其中聯(lián)合組大鼠運(yùn)動功能得分最為突出(P<0.05)。見表2。

2.3免疫組化研究結(jié)果四組大鼠隨時(shí)間推移GFAP、GAP-43和突觸素的含量都有所增加，但是運(yùn)動組、川芎嗪組和聯(lián)合組3種蛋白含量增加的量都顯著大于空白組(P<0.05)，其中聯(lián)合組大鼠3種蛋白含量增加的最為明顯(P<0.05)。見表3。

表2　四組大鼠橫木行走試驗(yàn)結(jié)果±s,n=20，分)

表3　四組大鼠免疫組化研究結(jié)果±s,n=10)

3討論

本研究提示當(dāng)機(jī)體發(fā)生急性腦梗死反應(yīng)后，梗死部位周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)連接仍然完整，且腦梗死會觸發(fā)病灶周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，重建神經(jīng)傳導(dǎo)連接。這一觀點(diǎn)也可以從空白組大鼠在第1、3及6周末的腦切片電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)其星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸數(shù)目逐漸增加這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象加以印證。由此可見，這種本身即存在的星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸再生機(jī)制是腦梗死后運(yùn)動功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。突觸素的含量多少與突觸的功能恢復(fù)密切相關(guān)。由此可以推測，早期的運(yùn)動訓(xùn)練可以有效幫助病灶區(qū)域附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和突觸的產(chǎn)生，這一推論也和其他許多研究相符合〔4,5〕。方南燕等〔6〕研究指出早期的運(yùn)動訓(xùn)練對星形膠質(zhì)細(xì)胞增生有益。川芎嗪可以透過血腦屏障，具有活血化瘀，防止血小板凝結(jié)之功效，同時(shí)它還可以防止動脈粥樣硬化的發(fā)生，具體改善病灶區(qū)域微循環(huán)的作用。根據(jù)研究結(jié)果推測，改善病灶區(qū)域微循環(huán)也有利于星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的增生。此外，配合兩種方法可以同時(shí)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的增生，且效果比單獨(dú)使用一種方法更好。GAP-43是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細(xì)胞的再生過程〔7〕。在神經(jīng)元發(fā)育和再生過程中以高水平表達(dá)，可以幫助調(diào)解軸突延伸作用，同時(shí)還可以改變神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)〔8〕。但是本研究說明，病灶周圍神經(jīng)傳導(dǎo)的重建可以不是以神經(jīng)元的再生為主導(dǎo)的。

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〔2015-07-21修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

〔中圖分類號〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2356-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.019

第一作者：閆春生(1972-)，男，碩士，講師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。