程　剛，胡容峰，3，4，王　斌，丁領(lǐng)振，方文悠

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥　230038；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230038；

3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥　230038；

4.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230038)

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HPLC-DAD雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定腦絡(luò)欣通膠囊中阿魏酸及天麻素含量

程剛1，2，胡容峰1，2，3，4，王斌2，丁領(lǐng)振1，方文悠1，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038；

3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥230038；

4.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038)

[摘要]目的建立雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定腦絡(luò)欣通膠囊中天麻素和阿魏酸含量的方法，為腦絡(luò)欣通的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器和Welch Materials C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈-0.01%磷酸；梯度洗脫(乙腈：0～10 min，6%；10～30 min，6%→35%)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm(阿魏酸)和222 nm(天麻素)。結(jié)果在30 min內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了阿魏酸與天麻素雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定，二者含量分別在0.20～2.39 μg(r=0.999 9)和0.20～2.41 μg(r=0.999 8)范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.5%和99.1%(n=6)。結(jié)論雙波長(zhǎng)檢測(cè)對(duì)復(fù)方中阿魏酸與天麻素定量更準(zhǔn)確，二者同時(shí)測(cè)定能有效提高分析效率，該方法可用于腦絡(luò)欣通膠囊的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜-二極管陣列器；雙波長(zhǎng)；腦絡(luò)欣通；阿魏酸；天麻素

川芎和天麻作為常用藥對(duì)[1]，存在于許多中藥復(fù)方如大芎丸(《圣濟(jì)總錄》卷十五)、天麻丸和九味羌活丸(《中華人民共和國(guó)藥典·一部》)，兩者同時(shí)作為天舒膠囊(《中華人民共和國(guó)藥典·一部》)腦絡(luò)欣通膠囊等中藥制劑有效成分，臨床上具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。阿魏酸和天麻素分別為中藥川芎和天麻中的活性成分，已有的含量測(cè)定方法[2-6]存在流動(dòng)相體系酸度較高，色譜峰保留時(shí)間長(zhǎng)，單一檢測(cè)波長(zhǎng)下天麻素的色譜峰響應(yīng)值較低等問題。因此，有必要建立較為有效的含量分析方法。腦絡(luò)欣通是新安醫(yī)學(xué)名家王樂匋治療缺血性腦血管疾病的臨床驗(yàn)方，由天麻、當(dāng)歸和川芎等藥物組成，全方具有活血通絡(luò)、熄風(fēng)養(yǎng)血的功效[7-8]，為新安醫(yī)學(xué)益氣活血代表方劑。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究[9]的基礎(chǔ)上，選擇高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD)雙波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)，建立阿魏酸和天麻素含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步完善腦絡(luò)欣通質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與儀器

1.1試藥天麻素(批號(hào)110807-200205，純度95.4%)、阿魏酸(批號(hào)110773-201012，純度99.6%)：均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；三七、黃芪、川芎、當(dāng)歸、天麻、紅花、蜈蚣等藥材：均購(gòu)自安徽合肥樂家老鋪中藥飲片廠，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系俞年軍教授鑒定符合2010版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)目的要求；腦絡(luò)欣通膠囊(每粒0.38 g，批號(hào)分別為140701、140801、140802)及陰性樣品均自制；乙腈(瑞典Oceanpak)為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2主要儀器硅膠G薄層板：山東省青島市基億達(dá)硅膠試劑廠；Agilent 1100型HPLC儀：美國(guó)安捷倫科技有限責(zé)任公司；Satorius BP211D型十萬分之一電子天平：德國(guó)賽多利斯有限公司；HS10260D型超聲波清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

2方法

2.1對(duì)照品貯備液的制備將阿魏酸和天麻素置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h，精密稱定阿魏酸對(duì)照品3.98 mg和天麻素對(duì)照品4.02 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2混合對(duì)照品溶液的制備精密移取1 mL天麻素和阿魏酸對(duì)照品貯備液，置于10 mL棕色容量瓶中，甲醇稀釋溶解，定容至刻度，搖勻，制成含阿魏酸39.8 μg/mL和天麻素40.2 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取膠囊內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。將上清液濾紙過濾。取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4陰性對(duì)照品溶液的制備按處方配比，稱取除川芎、當(dāng)歸以外和除天麻以外的其他藥材，按制備工藝制成膠囊，再取膠囊內(nèi)容物按“2.3”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.5色譜條件Welch Materials C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸溶液，梯度洗脫程序(0～10 min，乙腈6%；10～30 min，乙腈6%→35%)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為320 nm(阿魏酸)和222 nm(天麻素)。

2.6系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)按“2.5”項(xiàng)下色譜條件，分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液5 μL，進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，腦絡(luò)欣通中阿魏酸與天麻素有效成分均能與其他組分達(dá)到基線分離，且陰性樣品溶液無擾。色譜圖見圖1和圖2。

2.7線性關(guān)系的考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液5、10、20、30、40、60 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積y為縱坐標(biāo)，濃度x為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸和天麻素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。阿魏酸的回歸方程為y=2 957.8x+1.485 4(r=0.999 9)，線性范圍為0.20～2.39 μg；天麻素的回歸方程為y=2 019.4x-45.446(r=0.999 8),線性范圍為0.201～2.41 μg。

2.8精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算阿魏酸與天麻素峰面積的RSD分別為0.14%、0.22%。結(jié)果表明，儀器精密度良好，符合定量分析要求。

2.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液5 μL，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算阿魏酸與天麻素峰面積的RSD分別為0.48%、0.46%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)140701)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得阿魏酸與天麻素的峰面積，并計(jì)算阿魏酸與天麻素含量。結(jié)果顯示，阿魏酸和天麻素含量的RSD分別為1.26%、1.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.11加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)140701)6份，每份約0.1 g，分別加入混合對(duì)照品貯備溶液(含阿魏酸0.37 mg/mL，天麻素0.56 mg/mL)1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，分別吸取5 μL進(jìn)樣，記錄峰面積。根據(jù)加入量和測(cè)得量，計(jì)算加樣回收率。見表1。

表1　加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.12含量測(cè)定取批號(hào)分別為140701、140801、140802的膠囊樣品，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得每粒膠囊中阿魏酸的含量分別為1.42、1.43、1.41 mg,平均含量為1.42 mg ，RSD分別為1.30%、1.06%和0.28%；每粒膠囊中天麻素的含量分別為2.12、2.14、2.11 mg，平均含量為2.12 mg，RSD分別為2.09%、2.87%和0.39%。

3討論

已有報(bào)道[2，4，6]同時(shí)測(cè)定阿魏酸和天麻素的方法，但是流動(dòng)相體系酸度過大，單一波長(zhǎng)(270 nm)下檢測(cè)天麻素的響應(yīng)值較低，色譜峰保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在前期調(diào)研的基礎(chǔ)上，優(yōu)化色譜條件，采用梯度洗脫和雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定阿魏酸及天麻素，方法可行，提高了檢測(cè)的效率和靈敏度。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，阿魏酸性質(zhì)不穩(wěn)定，見光極易分解，因此，在研究中對(duì)照品和供試品制備過程中應(yīng)嚴(yán)格避光操作及保存。

分別配制兩種成分的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于紫外波長(zhǎng)200～400 nm范圍掃描，結(jié)果表明，阿魏酸在320 nm處有最大吸收，天麻素在222 nm處有最大吸收和270 nm有較弱的吸收，為了提高含量測(cè)定的靈敏度，故選擇相應(yīng)最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，使兩成分具有更高的響應(yīng)值，減少實(shí)驗(yàn)誤差，定量更準(zhǔn)確。

分別考察甲醇-1%醋酸水溶液、甲醇-0.01%磷酸水溶液以及乙腈-0.01%磷酸溶液，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%磷酸水溶液色譜峰更尖銳，峰形較對(duì)稱。其中流動(dòng)相體系中0.01%磷酸水溶液(pH值6～7)條件下能更好地保護(hù)色譜柱。同時(shí)分別考察了Welch Materials C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Materials C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)對(duì)阿魏酸和天麻素分離效果的影響。結(jié)果顯示，Welch Materials C8色譜柱對(duì)二者的分離效果更好。

本研究結(jié)果表明，雙波長(zhǎng)檢測(cè)對(duì)復(fù)方中阿魏酸與天麻素定量更準(zhǔn)確，二者同時(shí)測(cè)定能有效提高分析效率。該方法合理可靠，可用于腦絡(luò)欣通膠囊的質(zhì)量控制。

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Simultaneous Determination of Ferulic Acid and Gastrodin in Naoluoxintong Capsule by Dual-wavelength High-performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector

CHENGGang1,2,HURong-feng1,2,3,4,WANGBin2,DINGLing-zhen1,FANGWen-you1,2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicine,MinistryofEducation,AnhuiHefei230038,China; 3.Anhui“115”Xin’anTraditionalChineseMedicineResearch&DevelopmentInnovationTeam,AnhuiHefei230038,China; 4.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a dual-wavelength method for simultaneous determination of the content of gastrodin and ferulic acid in Naoluoxintong Capsule, and to provide a basis for the quality control of Naoluoxintong Capsule. MethodsHigh-performance liquid chromatography-diode array detector and Welch Material C8column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) were applied. The conditions for detection were a mobile phase of acetonitrile and 0.01% phosphoric acid, gradient elution (acetonitrile: 0-10 min, 6%; 10-30 min, 6%-35%), a flow rate of 1.0 mL/min, a column temperature of 35 ℃, and a detection wavelength of 320 nm (ferulic acid) or 222 nm (gastrodin). ResultsThe dual-wavelength simultaneous determination of the content of ferulic acid and gastrodin was realized within 30 min. The content of ferulic acid and gastrodin was in a good linear relationship with peak area within 0.20-2.39 μg (r=0.999 9) and 0.20-2.41 μg (r=0.999 8), respectively. The average recovery rates of ferulic acid and gastrodin were 99.5% and 99.1%, respectively (n=6). ConclusionThe dual-wavelength determination of the content of ferulic acid and gastrodin in the compound is more accurate. Simultaneous determination of the two ingredients can increase analysis efficiency effectively, and can be applied as the method of quality control for Naoluoxintong Capsule.

[Key words]high-performance liquid chromatography-diode array detector; dual wavelength; Naoluoxintong; ferulic acid; gastrodin

收稿日期：(2015-06-10；編輯：張倩)

通信作者：胡容峰，hurongfeng@163.com

作者簡(jiǎn)介：程剛(1991-)，男，碩士研究生

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAI26B03)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81274100)；安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(皖人社秘2011-38號(hào)-26)

[中圖分類號(hào)]R927.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.026