邵　俊，查必祥，袁愛紅，楊　駿，張金靜，薛秋菊，翟靜靜

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥　230031；

2.安徽中醫(yī)藥大學研究生部，安徽 合肥　230038)

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電針對糖尿病大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表達及胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響

邵俊1，查必祥1，袁愛紅1，楊駿1，張金靜1，薛秋菊2，翟靜靜2

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031；

2.安徽中醫(yī)藥大學研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察針刺對糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡的影響。方法高脂高糖飼料喂養(yǎng)加低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射復制糖尿病大鼠模型，按血糖分層將模型復制成功的大鼠隨機分為模型組、針刺組和二甲雙胍組，另設空白組。干預4周后檢測隨機血糖、大鼠胰腺組織CHOP、Bcl-2、Bax蛋白含量，觀察胰腺細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果模型復制后，模型復制組隨機血糖顯著高于空白組(P<0.05)。針刺組和二甲雙胍組隨機血糖均較治療前明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，針刺組隨機血糖水平呈降低趨勢(P>0.05)。模型組CHOP、Bax蛋白含量明顯高于空白組(P<0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著低于空白組(P<0.05)；模型組、針刺組和二甲雙胍組CHOP、Bax蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；針刺組和二甲雙胍組Bcl-2蛋白含量均顯著高于模型組(P<0.05)。針刺組和二甲雙胍組胰腺細胞線粒體排列整齊，在空泡變性，線粒體嵴斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形，糖原顆粒減少方面，其異常變化較模型組明顯減輕。結(jié)論針刺可通過改善糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，良性調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白含量，從而保護胰腺細胞。

[關鍵詞]糖尿?。绘滊遄艟?；針刺；CHOP；Bax；Bcl-2

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是指由多種因素如高糖高脂、低氧、化學毒物等使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+耗竭、蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵錯配以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)向高爾基體轉(zhuǎn)運減少，導致未折疊蛋白和(或)錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積以及打破Ca2+的平衡狀態(tài)，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生改變。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[1]，其啟動的凋亡途徑是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑。CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)是該凋亡途徑相關的凋亡信號分子中最重要的成員之一。針刺是否可以通過對CHOP蛋白的調(diào)節(jié)而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而抑制胰腺細胞凋亡？本研究將對此進行探討。

1材料

1.1實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠80只，購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心，體質(zhì)量(220±20)g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。飼養(yǎng)在安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室動物飼養(yǎng)房，室溫為(27±3)℃，相對濕度為(55±5)%，保持通風，自由飲水和攝食。

1.2主要儀器和試劑血糖儀及試紙：美國強生公司；LX 300型微量離心機：江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司；EPS 300型電泳儀：Tanon公司；H-7500型透射電鏡：Hitachi日立公司；G6805Ⅱ型電針儀：江蘇省蘇州醫(yī)療器械有限公司；華佗牌針灸美容針：蘇州天協(xié)針灸器械有限公司。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：美國Sigma公司；戊二醛：北京化學試劑公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒：美國Thermo公司；RIPA細胞裂解液(強)：碧云天生物技術研究所。

2方法

2.1動物分組電腦隨機數(shù)字法選取10只大鼠作為空白組，全價鼠飼料喂養(yǎng)；剩余70只大鼠高糖高脂飼料(飼料配制于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)喂養(yǎng)4周后，連續(xù)2 d腹腔注射小劑量STZ 30 mg/kg，注射前均禁食12 h，注射后繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1周后，尾靜脈采血測隨機血糖，血糖大于16.7 mmol/L提示模型復制成功，即STZ糖尿病大鼠，共30只(稱為“模型復制組”以區(qū)別后文“模型組”)，將其按血糖分層隨機分為模型組、針刺組和二甲雙胍組，每組10只。

2.2干預方法①針刺組：將大鼠以自制固定器固定，75%乙醇棉球無菌操作穴位，采用一次性無菌針灸針(規(guī)格：0.18 mm×13 mm)針刺，刺入2～4 mm深，小幅度持續(xù)勻速捻轉(zhuǎn)1 min，后三里和內(nèi)庭穴接通G6805 Ⅱ型電針儀(連續(xù)波，1 mA，10 Hz)。每次取一側(cè)肢體，兩側(cè)肢體輪流選取，每次治療15 min，每日針刺1次，7次為1個療程，共4個療程。二甲雙胍組：根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”確定大鼠的灌胃藥量，二甲雙胍100 mg/kg，研磨成粉末，與蒸餾水(加溫)混合成20 mg/mL的溶液，按大鼠體質(zhì)量所需要的藥物量進行灌胃給藥。每日灌胃1次，療程與針刺組平行。②模型組和空白組：與針刺組同樣固定，但不作任何處理，療程與針刺組平行。干預期間各組大鼠均自由攝食、飲水，4組均為SPF級全價鼠飼料。

2.3觀察指標及方法干預4周后，用美國強生型血糖儀測隨機血糖，用10%水合氯醛腹腔麻醉后置冰碟上，快速取出胰體、胰尾，用0.9%生理鹽水沖洗，紗布吸干后放入EP管中，置液氮中保存。另每組取1只大鼠的胰體、胰尾置2.0%戊二醛中固定。

2.3.1胰腺組織CHOP、Bcl-2、Bax蛋白含量檢測稱取胰腺組織進行細胞裂解、勻漿、離心，取其上清液，向上清液中加入等量的2倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，加熱變性后冷卻，通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后進行一抗孵育(兔抗，1∶800稀釋)和二抗孵育(1∶10 000稀釋)，最后采用ECL化學發(fā)光，置定影液中進行定影。

2.3.2胰腺細胞的電鏡觀察取出胰腺組織，浸泡固定2 h(4 ℃，pH=7.2)，修切成1 mm×1 mm×3 mm大小的組織塊后，用0.07 mol/L PBS、0.19 mol/L蔗糖緩沖液充分清洗，再用1.0%鋨酸、0.24 mol/L PBS后固定2 h，漂洗、梯度乙醇脫水，浸泡過夜，次日從37 ℃(12 h)、45 ℃(12 h)到60 ℃(12 h)依次進行加溫聚合，再行超薄切片，最后經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛電子染色，用Hitachi-7500型透射電鏡觀察和攝像。

3結(jié)果

3.1一般情況STZ注射后1周，模型復制組大鼠飲水量、進食量及尿量較前明顯增多。實驗過程中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，反應靈敏，毛發(fā)平伏亮澤，體質(zhì)量逐漸增加；模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)枯黃，多數(shù)出現(xiàn)尾部及指甲潰爛、大便干結(jié)等表征，體質(zhì)量均明顯減輕，死亡2例；針刺組、二甲雙胍組大鼠的精神狀況較空白組稍差，但明顯好于模型組，飲水量、飲食量及尿量較模型組有所減少，體質(zhì)量較治療前沒有明顯減輕，毛發(fā)光亮，未見尾部及指甲潰爛。

3.2隨機血糖變化模型復制前，模型復制組與空白組隨機血糖比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型復制后，模型復制組隨機血糖顯著高于空白組(P<0.05)。見表1。治療前，模型組、針刺組和二甲雙胍組隨機血糖水平顯著高于空白組(P<0.05)；治療后，模型組和空白組較干預前隨機血糖均有所升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，針刺組和二甲雙胍組隨機血糖均較治療前明顯降低(P<0.05)；二甲雙胍組隨機血糖降低值顯著大于模型組(P<0.05)。見表2。

表1　模型復制前后兩組大鼠隨機血糖比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；

與同組模型復制前比較，#P<0.05。

表2　實驗干預前后各組大鼠隨機血糖比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與同組治療前相比，#P<0.05；與模型組差值比較，△P<0.05。

3.3各組大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2蛋白含量比較模型組CHOP、Bcl-2蛋白含量明顯高于空白組(P<0.05)，Bax蛋白含量顯著低于空白組(P<0.05)；模型組、針刺組和二甲雙胍組CHOP、Bax蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；針刺組和二甲雙胍組Bcl-2蛋白含量均顯著低于模型組(P<0.05)。見表3、圖1。

表3　各組大鼠胰腺組織CHOP、Bax、Bcl-2表達水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

注：1.空白組；2.模型組；3.針刺組；4.二甲雙胍組。

3.4電鏡下各組大鼠胰腺細胞形態(tài)學觀察空白組大鼠胰腺細胞可見豐富而排列整齊的線粒體，線粒體嵴密集清晰，呈同心圓排列；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，清晰呈條索狀；細胞漿周圍有多量聚集成堆的酶原顆粒，凸向細胞漿。提示空白組胰腺細胞形態(tài)未受到明顯破壞。模型組可見少量散在分布的線粒體，出現(xiàn)不同程度的空泡變性、嵴距離明顯擴張及斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、斷裂，核染色質(zhì)有邊集濃染現(xiàn)象；酶原顆粒明顯減少。提示模型組胰腺細胞受到明顯的破壞。針刺組線粒體排列較整齊，少數(shù)出現(xiàn)不同程度的空泡變性、腫脹、嵴擴張，未見嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有擴張、變形，少數(shù)出現(xiàn)斷裂，排列較規(guī)律；酶原顆粒豐富，散在分布在細胞漿周圍。提示針刺組大鼠胰腺細胞形態(tài)異常明顯輕于模型組，但仍未恢復到空白組水平。二甲雙胍組線粒體數(shù)目正常，部分出現(xiàn)空泡變性、嵴輕度擴張，未見嵴斷裂，細胞核邊集；少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、斷裂，排列紊亂；酶原顆粒略減少，散在分布在細胞漿周圍。提示二甲雙胍組大鼠胰腺細胞形態(tài)異常明顯輕于模型組，但仍未恢復到空白組水平。見圖2。

4討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動的凋亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑，與該途徑相關的重要凋亡信號分子有很多，CHOP是其中最重要的成員之一。CHOP/生長抑制和DNA損傷誘導基因153是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異的轉(zhuǎn)錄因子[2]，是一個由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號分子。研究顯示，生理狀態(tài)下CHOP表達水平十分低下，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時CHOP被大量激活，CHOP的持續(xù)升高通過影響細胞內(nèi)鈣的代謝和改變Bcl家族成員來啟動細胞凋亡[3-6]。CHOP可上調(diào)促凋亡基因bax/bak，同時下調(diào)抗凋亡基因bcl-2。過表達的CHOP會導致胞質(zhì)內(nèi)Bax/Bak向線粒體轉(zhuǎn)移，并引起定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Bax/Bak構(gòu)象發(fā)生改變，最終可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的完整性，導致Ca2+向胞質(zhì)外流。Bcl-2蛋白表達的減少可增加線粒體對促凋亡因子的敏感性[5]，最終啟動Caspase級聯(lián)反應[6]。

針灸治療2型糖尿病療效顯著，可控制和改善并發(fā)癥。既往研究顯示，針刺具有調(diào)控脂肪細胞因子[7]、干預胰島素信號[8]以及保護胰島β細胞形態(tài)和功能[9]等作用，從而治療2型糖尿病。本研究顯示，糖尿病大鼠胰腺組織CHOP蛋白表達較空白組明顯升高，針刺治療可以顯著降低CHOP蛋白表達，與二甲雙胍水平相當。說明糖尿病大鼠胰腺組織存在著CHOP介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，而針刺治療可有效干預CHOP的蛋白表達，從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，這可能是針刺治療2型糖尿病的作用機制之一。糖尿病大鼠胰腺細胞Bax蛋白表達較空白組顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，針刺治療可有效下調(diào)Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(P<0.05)，說明針刺治療可顯著抑制糖尿病大鼠胰腺細胞凋亡。電鏡結(jié)果顯示，模型組胰腺細胞明顯受損，針刺組和二甲雙胍組胰腺細胞形態(tài)較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，但仍不及空白組，提示針刺治療可有效保護糖尿病大鼠胰腺組織的細胞形態(tài)。同時，針刺組CHOP蛋白表達與模型組相比有下降趨勢卻無統(tǒng)計學意義，但與二甲雙胍在同一水平，這可能與針刺治療的調(diào)節(jié)有限性或治療的療程長短有關，需進一步研究。針刺對STZ誘導的糖尿病大鼠有著明顯的降糖作用，這與筆者既往研究[10]相似。但從其降糖效應與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義，同時其降糖效應又與二甲雙胍組同當，這可能與樣本量不足或療程較短有關，有待下一步研究。

糖尿病屬中醫(yī)學“消渴”范疇，本實驗選用了后三里、內(nèi)庭和胰俞3個穴位治療，后三里為足陽明胃經(jīng)合穴，且為胃的下合穴。早在《素問·陰陽別論》就認為“二陽結(jié)謂之消”，又指出“二陽者，陽明也”。胃中熱盛，陰津枯竭，水谷即消。內(nèi)庭為足陽明胃經(jīng)滎穴，《難經(jīng)·六十八難》有“滎主身熱”，而消渴病正是以陰虛為本，燥熱為標。后三里配內(nèi)庭可清泄陽明之熱。胰俞為治療消渴病的經(jīng)外奇穴，又名胃管下輸，首見于《備急千金要方》，其主治“消渴咽喉干、口干”，現(xiàn)仍為臨床治療糖尿病的特效穴位。三穴配伍經(jīng)本課題組前期研究[11]已經(jīng)證實對于糖尿病具有良好的療效。

參考文獻:

[1]Rieusset J. Mitochondria and endoplasmic reticulum: mitochondria-endoplasmic reticulum interplay in type 2 diabetes pathophysiology[J]. Int J Biochem Cell Biol，2011，43(9)：1257-1262.

[2]Oyadomari S，Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death Differ，2004，11(4):381-389.

[3]Lin JH，Li H，Yasumura D，et al. IRE1 signaling affects cell fate during the unfolded protein response [J].Science，2007，318(5852):944-949.

[4]Timmins JM，Ozcan L，Seimon TA，et al. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ links ER stress with Fas and mitochondrial apoptosis pathways[J]. J Clin Invest，2009，119(10):2925-2941.

[5]高小玲，羅子國.雙氫青蒿素誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡及其機制研究[J].中草藥，2010，41(1)：9-13.

[6]Wu J，Kaufman RJ. From acute ER stress to physiological roles of the unfolded protein response[J].Cell Death Differ，2006，13(3):374-384.

[7]袁愛紅，劉志誠，魏群利，等.針刺2型糖尿病大鼠脂肪細胞因子的變化[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(20): 3915-3919.

[8]馬建華，王昱政，趙琳.針刺對2型糖尿病肥胖大鼠瘦素、胰島素抵抗和脂聯(lián)素水平影響的實驗研究[J].新中醫(yī)，2012，44(11):134-137.

[9]孫志，韓海榮，馬麗，等.針刺對2型糖尿病大鼠胰島β細胞形態(tài)學影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(12):1971-1974.

[10]袁愛紅，鮑淘淘，倪英群，等.針刺對糖尿病大鼠下丘腦弓狀核IRS1/PI3K途徑的影響[J].中國老年學雜志，2014，9(34)：5145-5148.

[11]高大紅.針刺對2型糖尿病大鼠下丘腦GLUT3和GLUT4基因和蛋白的影響[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學，2012.

·針灸經(jīng)絡·

Effects of Electroacupuncture on Protein Expression of CHOP, Bax, and Bcl-2 in Pancreatic Tissue and Ultrastructure of Pancreas in Diabetic Rats

SHAOJun1,ZHABi-xiang2,YUANAi-hong1,YANGJun1,ZHANGJin-jing2,XUEQiu-ju2,ZHAIJing-jing2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on endoplasmic reticulum stress and cell apoptosis in the pancreatic tissue of diabetic rats. MethodsA rat model of diabetes was induced by high-fat and high-sugar feeding and intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin. The model rats were randomly divided into model group, acupuncture group, and metformin group according to blood glucose stratification; in addition, healthy rats were assigned to blank group. After 4 weeks of treatment, the levels of random blood glucose and proteins (Bax, Bcl-2, and CHOP) were determined, and the ultrastructure of pancreas was observed. ResultsAfter the model was established, the content of random blood glucose in the model group was significantly higher than that in the blank group (P<0.05). The acupuncture group and metformin group showed significant decreases in random blood glucose after treatment (P<0.05); compared with the model group, the acupuncture group showed a nonsignificant decrease in random blood glucose (P>0.05). Compared with the blank group, the model group had significantly higher levels of CHOP and Bax (P<0.05) but a significantly lower Bcl-2 level (P<0.05); there were no significant differences in the content of CHOP and Bax between the model group, acupuncture group, and metformin group (P>0.05); the content of Bcl-2 in the acupuncture group and metformin group was significantly lower than that in the model group (P<0.05). When compared with the model group, the acupuncture group and metformin group had significantly reduced abnormal changes with respect to vacuolar degeneration, rupture of mitochondrial cristae, rough endoplasmic reticulum deformation, and reduction in glycogen granules. ConclusionAcupuncture can improve the endoplasmic reticulum stress in the pancreas of diabetic rats and regulate the content of Bcl-2 and Bax, thus protecting pancreatic cells.

[Key words]diabetes; streptozotocin; acupuncture; CHOP; Bax; Bcl-2

收稿日期：(2015-05-10；編輯：曹健)

通信作者：袁愛紅，yuanah2004@aliyun.com

作者簡介：邵俊(1980-)，男，主治醫(yī)師

基金項目：國家自然科學青年基金項目(81202769)

[中圖分類號]R587.1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.017