李蘭+劉俊+王豐

摘要 建立了測定膠囊殼中20種禁用工業(yè)染料的高效液相色譜-二極管陣列檢測器法。樣品經(jīng)乙腈-甲醇溶液（1∶2， V/V）超聲提取3次，以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱為分析柱，用乙腈和含0.3%三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）進(jìn)行梯度洗脫，同時在360、420、460、570和630 nm的檢測波長下監(jiān)測。結(jié)果表明，20種禁用工業(yè)染料在0.5～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9991～1.0000，檢出限為0.05～0.27 μg/mL。在1，3和10 μg/g加標(biāo)水平下，20種禁用工業(yè)染料的回收率為64.1%～114.9%，日內(nèi)及日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%～9.9%和0.9%～9.9%，定量限為0.16～2.33 μg/g。本方法操作簡單，分析快速，靈敏度好，適用于膠囊殼中禁用工業(yè)染料的日常檢測。

關(guān)鍵詞 工業(yè)染料； 膠囊殼； 高效液相色譜； 二極管陣列檢測

2015-12-29收稿； 2016-03-10接受

本文系國家質(zhì)檢總局資助項目（No.2014IK258）

E-mail： wangfeng62@126.com； xll1115@sina.com

1 引 言

工業(yè)染料是用于紡織品、皮革制品以及木制品著色的物質(zhì)，以偶氮型和蒽醌型結(jié)構(gòu)為主，長期使用會產(chǎn)生致敏或致癌作用[1，2]。我國衛(wèi)生部于2008年公布的第一批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中已明確指出工業(yè)染料為非食用物質(zhì)。

膠囊殼一般由明膠、食用色素及其它材料組成，它是一種特殊的藥物和食品輔料，可隨藥物制劑或食品一起食用，為人體所吸收[3]。市售的膠囊殼顏色多彩鮮艷，常見的有紅、黃、藍(lán)、白等著色。但食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中并無關(guān)于特殊商品藥品中著色劑的使用限量[4]，而且《中國藥典》中“藥用空心膠囊”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中也未對著色劑進(jìn)行相關(guān)的檢測及限定，因此，建立膠囊殼中禁用工業(yè)染料的檢測方法是很有必要的。

目前，檢測食品中禁用工業(yè)染料的方法已有報道，如薄層色譜法（TLC）[5]、伏安法[6]、極譜法[7]和分光光度法[8]。這些方法簡單、快速，但靈敏度低，不適合復(fù)雜基質(zhì)中混合染料的測定； 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[9～11] 靈敏度高，分辨率好，但儀器價格昂貴，操作繁瑣，檢測成本高； 液相色譜法（HPLC）[12，13] 使用最為普遍，簡單快速，配置二極管陣列檢測器減少了數(shù)據(jù)分析時間且兼顧了高的靈敏度和準(zhǔn)確度[14，15]。劉敏等[16]在32 min內(nèi)測定了15種工業(yè)染料（多為酸性染料）； 范文銳等[17]在25 min內(nèi)測定了7種非食用色素； 張昊等[18]在25 min內(nèi)測定了堿性橙Ⅱ等6種工業(yè)染料。基于此，本研究建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器法，在30 min內(nèi)完成了膠囊殼中20種禁用工業(yè)染料的有效分離，并獲得了良好的線性范圍、回收率和精密度。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200 series高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）； SmarVapor RE 501 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國DeChem-Tech公司）； Allegra X-22R高速冷凍離心機（德國Beckman公司）； 8011ES破碎儀（美國Waring公司）； KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Milli-Q超純水一體機（Millipore公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯過濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）； 三乙胺（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）； H3PO4（分析純，西安化學(xué)試劑廠）； 20種禁用工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）：分散藍(lán)1（CAS： 2475-45-8）、分散藍(lán)3（CAS： 2475-46-9）、分散藍(lán)7（CAS： 3179-90-6）、分散藍(lán)35（CAS： 12222-75-2）、分散藍(lán)106（CAS： 12223-01-7）、分散藍(lán)124（CAS： 61951-51-7）、分散橙1（CAS： 2581-69-3）、分散橙3（CAS： 730-40-5）、分散橙11（CAS： 82-28-0）、分散橙37（CAS： 13301-61-6）、分散紅1（CAS： 2872-52-8）、分散紅11（CAS： 2872-48-2）、分散紅17（CAS： 3179-89-3）、分散黃1（CAS： 119-15-3）、分散黃3（CAS： 2823-40-8）、分散黃49（CAS： 54824-37-2）、分散棕1（CAS： 23355-64-8）、堿性紅9（CAS： 569-61-9）、酸性紅26（CAS： 3761-53-3）、直接紅28（CAS： 573-58-0）。

稱取20種禁用工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg（精確至0.0001 g），用甲醇溶解并定容至25 mL，制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃保存。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇逐級稀釋為不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

將20種禁用工業(yè)染料分為A組和B組。其中A組混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的組成為：分散藍(lán)1、分散藍(lán)106、分散橙1、分散橙3、分散橙37、分散紅1、分散紅11、分散紅17、分散黃1、分散黃3、分散黃49、分散棕1、酸性紅26和直接紅28； B組混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的組成為：分散藍(lán)3、分散藍(lán)7、分散藍(lán)35、分散藍(lán)124、分散橙11和堿性紅9。

20種不同品牌的膠囊均購自烏魯木齊市售藥店。將膠囊中的內(nèi)容物傾出，利用棉簽清除膠囊殼內(nèi)壁上的內(nèi)容物，粉粹混勻備用。

2.2 樣品制備

稱取1.0 g粉碎均勻的樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi)，加入2.0 g無水Na2SO4，再加入10 mL乙腈-甲醇溶液（1∶2， V/V），渦旋混勻1 min，超聲提取10 min，10000 r/min離心5 min，將上層提取液移至旋蒸瓶中，重復(fù)上述操作3次，合并提取液，40℃水浴旋蒸至盡干后，用甲醇溶解并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后供HPLC分析。

2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，4.5 μm）； 流動相A：乙腈； 流動相B：含0.3% 三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）； 梯度洗脫程序為：0～3 min，25%～30% A； 3～4 min，30%～45% A； 4～20 min，45%～47% A； 20～22 min，47%～80% A； 22～28 min，80%～80% A； 28～30 min，80%～25% A； 30～32 min，25%～25% A。流速：1 mL/min； 柱溫：50℃； 檢測波長：360， 420， 460， 570和630 nm； 光譜掃描范圍：200～800 nm； 進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 定性與定量分析方法

以樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時間和DAD三維光譜圖進(jìn)行定性分析，以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 流動相的選擇 采用梯度洗脫，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈-含0.3%三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）作為流動相時，20種禁用工業(yè)染料的分離效果。結(jié)果表明，甲醇-水和乙腈-水作為流動相時，分離效果差，部分目標(biāo)物質(zhì)未出峰； 乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，目標(biāo)物質(zhì)全部出峰，但分散黃3和分散橙3不能實現(xiàn)有效分離，且色譜峰拖尾； 乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相時，目標(biāo)物質(zhì)基本達(dá)到有效分離，但色譜峰拖尾未能得到有效改善?？紤]到20種禁用工業(yè)染料大多含有NH2、NH、NN等堿性基團(tuán)，在反相分離模式下，需加入適量的有機胺抑制氨基與色譜柱表面殘余硅醇基之間的相互作用，從而提高分離效率，改善峰形。因此，本實驗選擇乙腈-含0.3%三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）作為流動相。

3.1.2 柱溫的選擇 將柱溫分別設(shè)定為30， 35， 40， 45， 50和55℃，比較20種目標(biāo)物的分離效果，隨著溫度升高，流動相的密度、粘度減小，柱壓減小，改善了傳質(zhì)，提高了分析速度[19]。但色譜柱的使用壽命也會減少，因此本實驗確定柱溫為50℃。

3.1.3 檢測波長的選擇 為了考察檢測波長對目標(biāo)物質(zhì)檢測靈敏度的影響，實線為A組（The solid lines indicate chromatograms of group A）； 虛線為B組（The dotted lines indicate chromatograms of group B）； 色譜峰編號同表1（The peak numbers are the same as in Table 1）。二極管陣列檢測器于200～800 nm波長范圍內(nèi)對20種禁用工業(yè)染料進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明，20種禁用工業(yè)染料分別在360 nm（分散黃1、分散黃3）、420 nm（分散橙3、分散橙37）、460 nm（分散橙1、分散橙11、分散紅1、分散紅17、分散黃49、分散棕1、酸性紅26、直接紅28）、570 nm（分散紅11、分散藍(lán)124、堿性紅9）、630 nm（分散藍(lán)1、分散藍(lán)3、分散藍(lán)7、分散藍(lán)35、分散藍(lán)106）處有較大吸收。因此，本實驗采用多波長檢測，檢測波長為360， 420， 460， 570和630 nm。

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

20種禁用工業(yè)染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中部分色譜峰重疊未完全分離，因此為了避免色譜峰重疊對加標(biāo)回收率的影響，將20種禁用工業(yè)染料分為兩組。20種禁用工業(yè)染料的液相色譜圖見圖1。其中，分散藍(lán)7在色譜圖中主要有兩個色譜峰，因此需將峰面積加和后進(jìn)行定量分析。

配制7個不同濃度（0.1，0.5，1.0，5.0，10，15，20 μg/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各濃度峰面積y對相應(yīng)濃度x進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果見表1。20種禁用工業(yè)染料在0.5～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以信噪比為3時確定20種禁用工業(yè)染料的檢出限，其范圍為0.05～0.27 μg/mL。

3.2 樣品預(yù)處理方法考察

基于20種禁用工業(yè)染料大多含有羥基、胺基、氰基等水溶性較差的官能團(tuán)，實驗選擇甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷-乙醚溶液（1∶2， V/V）作為提取劑[17～19]，比較各提取溶劑的提取效率。丙酮、二氯甲烷-乙醚溶液作為提取劑時，酸性紅26和直接紅28未被提取出來，其余染料的回收率均在60%以上?？赡苁悄z囊殼樣品中蛋白質(zhì)的含量較高，在深加工的過程中酸性紅26或直接紅28與蛋白質(zhì)深度結(jié)合，導(dǎo)致回收率較低。乙腈作為提取溶劑時，除酸性紅26和直接紅28的回收率小于32%，其它目標(biāo)物的回收率均達(dá)到60%以上。而甲醇對20種禁用工業(yè)染料的提取率均達(dá)到70%以上（除分散黃49的18%及分散藍(lán)106的47%外）。綜合考慮，為了彌補乙腈和甲醇單獨提取時的不足，實驗進(jìn)一步考察了不同體積比時乙腈-甲醇溶液的提取效率。如圖2所示，當(dāng)乙腈-甲醇溶液體積比為1∶2時，20種禁用工業(yè)染料的回收率均大于60%。故本實驗選擇乙腈-甲醇溶液（1∶2， V/V）對樣品進(jìn)行提取。

3.3 加標(biāo)回收率、精密度和定量限

以除去內(nèi)容物的膠囊殼和商品膠囊殼的響應(yīng)值的百分比為藥品殘留效應(yīng)，評價膠囊殼中是否存在藥品殘留的干擾。當(dāng)藥品殘留效應(yīng)>1時，表現(xiàn)為存在干擾； 當(dāng)藥品殘留效應(yīng)<1時，表現(xiàn)為不存在干擾。結(jié)果表明，藥品殘留效應(yīng)均<1，因此膠囊殼中的藥品殘留效應(yīng)可忽略。

準(zhǔn)確稱取1.0 g的膠囊殼樣品，按2.2節(jié)和2.3節(jié)進(jìn)行前處理和儀器測定，當(dāng)信噪比<3時，確定樣品為陰性樣品。選取膠囊殼陰性樣品，添加3個不同加標(biāo)水平（1， 3和10 μg/g）進(jìn)行回收率實驗，每個添加水平重復(fù)6次，結(jié)果見表2。20種禁用工業(yè)染料日內(nèi)平均回收率為65.2%～114.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～9.9%； 日間平均回收率為64.1%～114.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～9.9%。20種禁用工業(yè)染料的定量限范圍為0.16（分散紅11）～2.33 μg/g（分散藍(lán)35）。

3.4 方法的應(yīng)用

應(yīng)用本方法對市售的20種不同品牌的膠囊（已除去內(nèi)容物）進(jìn)行測定，結(jié)果表明，20種禁用工業(yè)染料均未檢出。

4 結(jié) 論

本研究采用配置二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀建立了同時測定膠囊殼中20種禁用工業(yè)染料的分析方法。通過優(yōu)化和選擇最佳色譜條件，采用保留時間及DAD三維光譜圖雙重定性，最終在30 min內(nèi)完成了20種禁用工業(yè)染料的定量分析。本方法快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于膠囊殼中禁用工業(yè)染料的日常分析檢測。

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Abstract A high performance liquid chromatography with diode array detection method （HPLC-DAD） was established for determination of 20 forbidden industrial dyes in capsule shells. The capsule shell samples were repeatedly extracted three times under ultrasonication with acetonitrile-methanol solution （1∶2， V/V）. The extract was separated on Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column with gradient elution by using acetonitrile and 0.3% triethylamine， 0.2% phosphoric acid aqueous solution （pH 2.7） as eluant， and then monitored under the detection wavelength of 360， 420， 460， 570 and 630 nm. The results showed that the linearity of 20 forbidden industrial dyes ranged from 0.5 to 20 μg/ml with correlation coefficients of 0.9991-1.0000. The limit of detection of the instrument was 0.05 to 0.27 μg/mL. The recoveries of these dyes （spiked at levels of 1， 3， and 10 μg/g） ranged from 64.12% to 114.89%， while intra-day and inter-day relative standard deviations ranged from 0.4% to 9.9% and 0.9% to 9.9%， respectively. The Limit of quantification of the method was 0.16–2.33 μg/g. This method is sample， rapid and sensitive， and suitable for routine determination of the forbidden industrial dyes in capsule shells.

Keywords Industrial dyes； Capsule shell； High performance liquid chromatography； Diode array detection