粟有志+李芳+趙光躍+黃志強+雷紅琴+李艷美+陸平

摘 要 建立了高效液相色譜.串聯(lián)質譜法（HPLC.MS/MS）測定植物源食品中環(huán)磺酮殘留量的分析方法。樣品經(jīng)改進的QuEChERS方法一步完成萃取凈化，經(jīng)酸化乙腈（含0.1% （V/V）甲酸的乙腈）提取，經(jīng)石墨化碳黑（GCB）凈化，提取液經(jīng)離心后直接過膜上機檢測。HPLC.MS/MS方法以0.1%（V/V）甲酸.乙腈為流動相，在0.25 mL/min流速下梯度洗脫，采用C 18色譜柱進行液相色譜分離，電噴霧正離子電離（ESI+），多重反應監(jiān)測模式（MRM）檢測，基質匹配外標法進行定量分析。結果表明，在10種基質（玉米、大米、小麥、葡萄、蘋果、葡萄干、枸杞、西紅柿、黃瓜、白菜）中，環(huán)磺酮在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.996； 方法定量限（S/N≥10）為1.0 μg/kg； 在1.0， 2.0和10.0 μg/kg添加水平下，環(huán)磺酮的平均回收率為82.0%～111.8%，相對標準偏差為3.0%～14.9%。本方法高效快捷，靈敏度、準確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

關鍵詞 環(huán)磺酮； 植物源食品； 高效液相色譜.串聯(lián)質譜

1 引 言

環(huán)磺酮（Tembotrione）是由拜耳公司2007年研制的三酮類除草劑，商品名為Laudis，化學名：2.{2.氯.4.（甲磺?；?3.[（2，2，2.三氟乙氧基）甲基]苯甲?；鶀.1，3.環(huán)己二酮，化學結構式如圖1所示。其具有廣譜、作用快速的特性，主要防治玉米田大多數(shù)闊葉與禾本科雜草，如藜、莧、苘麻、稗、狗尾草、馬唐以及抗草甘膦、麥草畏雜草，目前已在奧地利、法國、巴西和美國等國家得到廣泛使用[1，2]。環(huán)磺酮屬于低毒農(nóng)藥，在動物組織中積累的風險較低，不會對DNA造成明顯損傷[3]。加拿大制定其在甜玉米的殘留限量為0.01 mg/kg[4]，但當前尚無食品中環(huán)磺酮殘留的檢測標準方法。針對環(huán)磺酮在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用的預期，以及國外可能的“技術性壁壘”，建立食品中環(huán)磺酮殘留的分析方法具有重要的意義。本研究建立了玉米、大米、西紅柿等植物源性食品中環(huán)磺酮的檢測方法，可為植物源性食品中環(huán)磺酮的檢測標準方法的建立提供參考依據(jù)。

關于環(huán)磺酮檢測方法的報道較少，僅見高效液相色譜（HPLC）法[5，6]和超高效液相色譜.飛行時間質譜（UHPLC.TOFMS）法[7]。Melo等[5]建立了環(huán)磺酮在土豆中的HPLC法，Hanna Barchanskal等[6]利用HPLC研究了環(huán)磺酮在土壤和沉積物中的降解規(guī)律。Pérez.Ortega1等[7]。利用UHPLC.TOFMS建立了包括環(huán)磺酮在內(nèi)的350種農(nóng)藥的篩查方法。但HPLC法一般檢出限較高、選擇性較差、抗基質干擾能力較弱； UHPLC.TOFMS雖然在定性方面優(yōu)勢突出，但其檢出限和定量準確性一般均不如液相色譜.串聯(lián)四級桿質譜。

目前，農(nóng)藥殘留分析前處理較常用的方法有固相提?。⊿PE）[8]、加速溶劑提?。ˋSE）[9]、凝膠滲透色譜法（GPC）[10] 和超聲波輔助提?。║SE）[11]等，但這些方法操作繁瑣，費時費力，甚至需要某些特殊的設備。QuEChERS是一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，已廣泛用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測[12～15]。本研究采用改進的QuEChERS方法，結合高效液相色譜.串聯(lián)四級桿質譜儀，建立了植物源食品中環(huán)磺酮的分析方法。本方法操作簡便快捷，精密度和回收率較好，適于植物源食品中環(huán)磺酮的定性與定量分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜.6460A型串聯(lián)質譜儀（Agilent公司）； Sigma3.18K臺式冷凍離心機（Sigma公司）； EYELA MMV.1000W振蕩器（東京理化公司）； GM 200刀式混合研磨儀（Retsch公司）； T18基本型均質器（IKA公司）； N.EVAP.112水浴氮吹儀（Organomation公司）； MiIIi.Q Advangtage A10 超純水系統(tǒng)（Millipore公司）； MS3型渦旋振蕩器（IKA公司）。

環(huán)磺酮標準品（純度為99%，Dr. Ehrenstorfer公司）； 乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙酸乙酯、正己烷（色譜純，Merck公司）； 實驗用水為超純水（符合GB/T 6682.2008一級水要求）； 石墨化炭黑（GCB）、酸性氧化鋁（ALA）和C 18、氨基（NH2）粉（Agilent公司）； 乙二胺.N.丙基硅烷（PSA）粒徑40～60 μm、苯磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯（PCX）粒徑40～60 μm、聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）粒徑70～90 μm（Agela公司）； 分析樣品為實驗室送檢和市售樣品。

2.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液：準確稱取標準品10 mg（精確至0.0001 g），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為1000 mg/L的標準儲備液，于儲存4℃?zhèn)溆谩?/p>

基質匹配標準曲線的配制：準確稱取5.0 g樣品（精確到0.01 g）按照2.3和2.4節(jié)條件進行前處理及儀器分析，當環(huán)磺酮的定性與定量離子信噪比<3時，樣品確定為空白基質； 空白基質按照2.3節(jié)條件前處理，獲得基質空白提取液，逐步用基質空白提取液將標準儲備液稀釋相應的工作濃度。

2.4 HPLC.MS/MS 條件

液相色譜條件：色譜柱為JADE.PAK CB.C 18柱 （100 mm×2.1 mm， 3 μm， Techway公司）； 柱溫為30℃； 進樣量為10.0 μL。流動相A為0.1%甲酸溶液， B為乙腈， 流速為0.25 mL/min， 梯度洗脫。洗脫程序如下：0～0.5 min， 10% B相； 0.5～1.5 min， 10%～65% B； 1.5～4.5 min， 65%～95% B； 4.5～5.5 min， 95% B相； 5.51～10 min， 10% B。

質譜條件：電噴霧正離子源模式（ESI+）； 多重反應監(jiān)測（MRM）； 干燥氣溫度300℃； 干燥氣流量10.0 L/min； 鞘氣溫度250℃； 鞘氣流速9.0 L/min， 毛細管電壓4 kV； 碎裂電壓140 V； 駐留時間50 ms； 監(jiān)測離子對分別為m/z 441.1>341.0， m/z 441.1>262.0， 碰撞能量分別為4和32 eV， 其中m/z 441.1>341.0為定量離子對。

3 結果與討論

3.1 儀器條件的優(yōu)化

配制1.0 mg/L環(huán)磺酮標準溶液， 分別采用電噴霧正離子模式（ESI+）和負離子模式（ESI）對其進行母離子掃描。結果表明， 環(huán)磺酮較適合于ESI+， 其準分子離子峰[M+H]+為m/z 441.1。進一步對子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化， 獲得環(huán)磺酮二級質譜全掃描圖見圖2。參照歐盟指令657/2002/EEC 決議中有關規(guī)定， 本研究選擇離子豐度最高、基質干擾最小的兩個離子對作為特征離子對， 其中信號較大的離子對作為定量離子。最終確定環(huán)磺酮的特征離子對為m/z 441.1>341.0和m/z 441.1>262.0， 其中m/z 441.1>314.0為定量離子對。

采用電噴霧正離子模式（ESI+）分析樣品時， 在流動相中加入微量的甲酸可提供目標化合物離子化所需要的H+， 微量的乙酸銨可以減少[M+Na]+離子的形成， 從而提高監(jiān)測離子的靈敏度。本研究比較不同濃度的甲酸、乙酸銨、甲酸.乙酸銨溶液、純水所組成的無機相（A相）， 乙腈、甲醇組成的有機相（B相）。通過A相與B相的組合比較分析發(fā)現(xiàn)， 0.1%甲酸（A）.乙腈（B）為流動相時， 環(huán)磺酮的離子化效率最佳。進一步確定A相和B相的比例， 結果如圖3所示， 當A∶B為1∶9， 2∶8和3∶7時， 環(huán)磺酮在色譜柱上幾乎不保留， 樣品基質干擾強烈， 監(jiān)測離子對信號較弱； 當A：B為4∶6和5∶5時， 環(huán)磺酮的基質干擾相對較小， 環(huán)磺酮的峰形有所改善， 但相對于梯度洗脫， 兩者的峰寬較大、峰形較差。故本研究選擇2.4節(jié)所述的梯度洗脫程序。

環(huán)磺酮的基質效應。結果表明， 酸化乙腈提取時， 環(huán)磺酮的基質干擾相對較小， 故選擇酸化乙腈作為提取劑。同時還考察了不加水浸泡枸杞樣品時， 酸化乙腈對環(huán)磺酮的提取效果。結果表明， 環(huán)磺酮的回收率為85.5%， 低于浸泡時的提取效率。

QuEChERS方法凈化樣品時， 常用PSA去除糖、有機酸和脂肪酸等干擾物， GCB除去葉綠素、類胡蘿卜素等色素化合物， C 18除去脂肪和脂類等非極性有機物。以富含色素、糖分的枸杞為分析樣品， 比較了PSA， C 18， PCX， PEP， NH2， ALA， GCB 7種吸附劑用量均為100 mg時對樣品的凈化效果。結果表明， 7種吸附劑凈化時， 環(huán)磺酮的回收率均在87%～106%， 均能滿足檢測方法學要求； 進一步比較環(huán)磺酮的基質效應發(fā)現(xiàn)， GCB凈化時， 樣品的基質干擾相對較小。同時GCB凈化后， 樣品提取液均較為清澈。故本研究最終GCB凈化樣品。

比較了GCB用量為10， 25， 50， 75， 100， 150和200 mg時環(huán)磺酮的回收率和基質效應。結果表明， GCB用量為10 mg凈化時， 用量過少， 環(huán)磺酮的基質干擾相對較大， 提取液呈淺黃色； GCB用量為為25～200 mg時， 環(huán)磺酮的回收率和基質效應無明顯差別， 提取液均較清澈； 考慮經(jīng)濟成本， 本研究最終選擇25 mg GCB凈化樣品。經(jīng)25 mg GCB凈化的空白枸杞、空白枸杞加標樣品的色譜圖見圖5。

QuEChERS方法前處理樣品時， 通常在提取液中加入適量無水MgSO4， 以達到吸附提取液中的水分或鹽析的效果。但研究發(fā)現(xiàn)， 加入MgSO4后， 環(huán)磺酮的響應信號下降， 可能由于MgSO4增加了提取液中離子濃度， 從而影響環(huán)磺酮離子化， 故本研究不使用MgSO4。

3.3 基質效應、標準曲線、檢出限和定量限

繪制溶劑標準溶液線性曲線和基質匹配標準溶液線性曲線， 計算和評價方法基質效應?；|效應系數(shù)以η表示：η= （基質匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率）/溶劑標準曲線的斜率。若|η|<10%， 說明無明顯基質效應； 反之， 則說明具有明顯基質增強或減弱效應[16]?？瞻讟悠钒凑?.3節(jié)方法處理， 獲得空白基質提取液， 逐級用空白基質提取液稀釋標準儲備液稀釋至0.5， 1， 2， 5， 10， 50和100 ng/mL， 獲得基質匹配標準曲線溶液； 同時用乙腈稀釋標準儲備液稀釋至0.5， 1， 2， 5， 10， 50和100 ng/mL， 獲得溶劑標準曲線溶液。由表1可知， 樣品基質對環(huán)磺酮均有減弱效應， 部分樣品基質效應明顯， 不可忽略。以峰面積（y）對農(nóng)藥的質量濃度（x）作線性回歸， 環(huán)磺酮在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)， 線性關系良好（相關系數(shù)均大于0.996）。環(huán)磺酮的線性方程詳見表1。用空白基質提取液逐級稀釋標準儲備溶液， 以信噪比S/N≥3和S/N≥10計算方法檢出限和定量限， 環(huán)磺酮的方法檢出限為0.3 μg/kg， 定量限為1.0 μg/kg。Melo等[5]建立的土豆中環(huán)磺酮的HPLC法， 檢出限為4.1 μg/kg； Barchanskal[6]建立的土壤和沉積物中環(huán)磺酮的HPLC法， 檢出限分別為24和15 μg/kg； Pérez.Ortega等[7]建立的果醬中環(huán)磺酮殘留的UHPLC.TOFMS法， 檢出限為2.9 μg/kg； 故本方法的檢出限明顯優(yōu)于上述文獻方法。

3.4 方法的準確度和精密度

選擇玉米、大米、小麥、葡萄、蘋果、葡萄干、枸杞、西紅柿、黃瓜和白菜空白樣品， 以1.0， 2.0和10.0 μg/kg（即定量限、中間濃度、加拿大最高殘留限量）為加標水平， 進行回收率實驗。所有樣品添加標準溶液后， 靜置30 min， 待農(nóng)殘被樣品充分吸收后， 按照2.3和2.4節(jié)條件進行前處理和測定， 每個水平重復6次。由表1可知：環(huán)磺酮的平均回收率為82.0%～111.8%， 相對標準偏差為3.0%～14.9%。

3.5 樣品測定

利用本方法對市售的10種植物源性食品（玉米、大米、小麥、葡萄、蘋果、葡萄干、枸杞、西紅柿、黃瓜、白菜）共計50余份樣品進行環(huán)磺酮殘留量監(jiān)測。結果表明， 樣品中環(huán)磺酮的含量未檢出。

4 結 論

本研究以酸化乙腈為提取劑， 樣品經(jīng)石墨化碳黑（GCB）吸附劑凈化， 通過色譜和質譜條件的優(yōu)化， 建立了植物源食品中環(huán)磺酮殘留的HPLC.MS/MS檢測方法。本方法簡便快捷、靈敏度高、實用性強， 符合殘留檢測的相關要求， 適用于植物源食品中環(huán)磺酮殘留量的快速檢測。

References

1 HUA Nai.Zhen. World Pesticides， 2015， 37（6）： 7-13

華乃震. 世界農(nóng)藥， 2015， 37（6）： 7-13

2 SU Shao.Quan， TENG Chun.Hong. Modernizing Agriculture， 2014， 4： 1-2

蘇少泉， 滕春紅. 現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)， 2014， 4： 1-2

3 unec S， Kauba V， Pavicic I， Marjanovic A M， Taribad B， MiliC M， Kopjarb N， Pizentd A， Vrdoljaka A L， Rozgajb R， eljei.a D. Food Chem. Toxicol.， 2016， 94： 64-74

4 http：//www.hc.sc.gc.ca/cps.spc/pest/part/consultations/pmrl2015.20/pmrl2015.20.eng.php

5 Melo A， Mansilha C， Pinho O， Ferreira I. Food Anal. Methods， 2013， 6（2）： 559-568

6 Barchanska H， Kluza A， Krajczewska K， Maj J. J. Soil. Sediment.， 2016， 16（1）： 125-133

7 Pérez.Ortega P， Lara.Ortega F J， García.Reyes J F， Beneito.Cambra M， Gilbert.López B， Martos N R， Molina.Díaz A. Food Anal. Methods， 2016， 9（7）： 1939-1957

8 SU You.Zhi， LI Fang， LI Yan.Mei， LEI Hong.Qin， LUO Qiong， LIU Xu.Bin. Chinese J. Anal. Lab， 2015， 34（4）： 433-441

粟有志， 李 芳， 李艷美， 雷紅琴， 羅 瓊， 劉緒斌. 分析試驗室， 2015， 34（4）： 433-441

9 Kadir H A， Abas F， Zakaria O， Ismail I S， Lajis N H. Anal. Methods， 2015， 7： 3141-3147

10 Qian M R， Zhang H， Wu L Q， Jin N， Wang J M， Jiang K Z. Food Chem.， 2015， 166： 23-28

11 Flores.Ramírez R， Medellín.Garibay S E， Castillo C G， Ilizaliturri.Hernández C A， Zuki.Orozco B A， Batres.Esquivel L， Díaz.Barriga F. Bull. Environ. Contam. Toxicol.， 2015， 95（2）： 207-214

12 Guedes J A C， de Oliveira Silva R， Lima C G， Milhome M A L， Nascimento R F D. Food Chem.， 2016， 199： 380-386

13 Rizzetti T M， Kemmerich M， Martins M L， Prestes O D， Adaime M B， Zanella R. Food Chem.， 2016， 196： 25-33

14 ZHANG Ai.Zhi， WANG Quan.Lin， CAO Li.Li， LI Yu， SHEN Hao， SHEN Jian， ZHANG Shu.Fen， MAN Zheng.Yin. Chinese Journal of Chromatography， 2016， 34（2）： 158-164

張愛芝， 王全林， 曹麗麗， 李 譽， 沈 昊， 沈 堅， 張書芬， 滿正印. 色譜， 2016， 34（2）： 158-164

15 RUAN Hua， RONG Wei.Guang， SONG Ning.Hui， JI Wen.Liang， LIU Hua.Liang， MA Yong.Jian. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1110-1116

阮 華， 榮維廣， 宋寧慧， 吉文亮， 劉華良， 馬永建. 分析化學， 2014， 42（8）： 1110-1116

16 DONG Mao.Feng， BAI Bing， TANG Hong.Xia， WANG Wei.Min， ZHAO Zhi.Hui， HAN Zheng， SONG Wei.Guo. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 663-668

董茂鋒， 白 冰， 唐紅霞， 王偉民， 趙志輝， 韓 錚， 宋衛(wèi)國. 分析化學， 2015， 43（5）： 663-668

Abstract A method for determination of tembotrione in vegetative foods using high performance liquid chromatography.tandem mass spectrometry （HPLC.MS/MS） was developed. The sample was pretreated using modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged and safe） method in which the extraction and clean.up steps were completed in one procedure. The sample was extracted with acidic acetonitrile （containing 0.1% formic acid）， and cleaned up by graphitized carbon black （GCB）， and then the extracting solution was centrifuged and filtrated before detection. The HPLC.MS/MS method was performed on a C 18 column with gradient elution of acetonitrile and 0.1% formic acid at a flow rate of 0.25 mL/min. The mass spectrometric analysis was carried out with electrospray positive ion source （ESI+）， and multiple reaction monitoring mode （MRM）. The matrix.matched external standard method was used for quantification. The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.5-100 ng/mL with the correlation coefficients larger than 0.996， the limits of quantification （LOQ， S/N≥10） were 1.0 μg/kg in ten different matrix （corn， rice， wheat， grape， apple， raisin， Chinese wolfberry， tomato， cucumber， cabbage）. The mean recovery of tembotrione was 82.0%-111.8% and the relative deviation （RSD） was 3.0%-14.9% at 1.0， 2.0 and 10.0 μg/kg with three spiked levels. The method is highly effective and suitable for the monitoring of pesticide residue analysis.

Keywords Tembotrione； Vegetative foods； High performance liquid chromatography.tandem mass spectrometry