章蕾+袁東星+方鍇+劉寶敏

摘 要 鐵載體是一種由海洋菌類合成并分泌、能特異性絡(luò)合海水中鐵的有機(jī)配體。本研究建立了固相萃取預(yù)處理、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海水中鐵載體化合物的分析方法。海水樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，其中鐵載體由ENVI-18萃取柱萃取、甲醇洗脫后得到富集凈化后的試樣； 采用SB-C18反向色譜柱以0.1%（V/V）甲酸溶液和甲醇溶液梯度洗脫分離，在質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式下檢測(cè)。3種鐵載體化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Pyoverdines-Fe， Ferrichrome， Ferrioxamine E的檢測(cè)線性范圍分別為0.001～3.0 μg/mL， 0.005～15.0 μg/mL， 0.001～3.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2>0.99； 儀器檢出限分別為0.08， 1.76 和1.36 ng/mL； 定量限分別0.27， 5.87和4.53 ng/mL。在海水樣品中添加鐵載體化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，3種目標(biāo)物測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<12%，方法回收率分別為Pyoverdines-Fe 12.1%～18.6%，F(xiàn)errichrome 82.0%～97.7%，F(xiàn)errioxamine E 70.0%～98.3%。

關(guān)鍵詞 鐵載體； 固相萃取； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 海水

1 引 言

不同于地表水，海洋表層的生物可利用態(tài)鐵（Fe）濃度極低，僅為nmol/L。鐵載體是一種低分子量（0.5～1.5 kDa）的有機(jī)配體[1]，對(duì)鐵有極強(qiáng)的螯合能力。在鐵限制條件下，鐵載體由海洋中的一些細(xì)菌和真菌合成并分泌到細(xì)胞外，與海水中的鐵特異性結(jié)合，通過細(xì)胞膜上特定鐵載體受體的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)，有效地將鐵運(yùn)輸?shù)轿⑸锛?xì)胞內(nèi)，滿足生物體對(duì)鐵的需求[1～3]。鐵載體種類繁多，根據(jù)其官能團(tuán)的不同，可分為氧肟酸型、酚-兒茶酚型和少量檸檬酸型。鐵載體是海洋生物量的重要影響因子，其定性定量分析數(shù)據(jù)的獲取是相關(guān)研究的關(guān)鍵。

由于鐵載體結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，在海洋環(huán)境中濃度低[4～6]，分析相對(duì)困難，一般需要采集大量水樣進(jìn)行萃取和富集。傳統(tǒng)的前處理方法，如液-液萃取法、柱層析法等[6～8]，存在著操作繁瑣、重現(xiàn)性較差等缺點(diǎn)； 而固相萃取法用于鐵載體萃取[9，10]具有重現(xiàn)性好、溶劑用量小、操作高效快速等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定鐵載體常用分光光度法，如CAS（Chrome azurol S test）法[11]用于大多數(shù)細(xì)菌和真菌分泌的鐵載體的檢測(cè)。Csky等[12]特異性檢測(cè)了氧肟酸型鐵載體； Arnow建立了測(cè)定酚-兒茶酚型鐵載體的方法[13]。上述方法易受基底干擾[1]，回收率差，靈敏度低。Kilz等[14]嘗試使用高效液相色譜-電噴霧離子源-質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS）篩選熒光素類鐵載體，該方法分析速度快，但僅用于定性分析。

已有的分析方法未能涵蓋種類繁多的鐵載體，且回收率均不佳。據(jù)文獻(xiàn)[9，15]報(bào)道，天然海水中能被檢測(cè)到的鐵載體均為氧肟酸型鐵載體，而含兒茶酚官能團(tuán)的鐵載體可能因親脂性相對(duì)較高，未能在水相中檢測(cè)得到。本研究旨在建立天然海水中鐵載體的分析方法，故選擇氧肟酸型鐵載體為研究對(duì)象，以固相萃取法對(duì)海水樣品進(jìn)行預(yù)處理，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定。本方法操作簡(jiǎn)便、基底干擾小，回收率優(yōu)于已報(bào)道的，并能提供目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息，適于海水基底中鐵載體的分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent6410 Triple Quad液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS，美國(guó)Agilent公司），配Agilent 1290液相色譜系統(tǒng)、電噴霧離子源（ESI）； Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）； 0.22 μm聚醚砜針式過濾器、0.22 μm聚醚砜濾膜（美國(guó)Pall公司）。

甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）； 甲酸（96%，ACS純，美國(guó)Sigma公司）； 乙腈（色譜純， 美國(guó)Tedia公司）； NaCl（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； HCl（工藝超純，昆山金城試劑有限公司）； NaOH（ACS試劑，美國(guó)Sigma公司）； 固相萃取柱：500 mg/6 mL Supelclean LC-18（美國(guó)Supelco公司），200 mg/6 mL Waters OASIS HLB（美國(guó)Waters公司），100 mg/1 mL Isolute ENV+（瑞典Biotage公司），500 mg/6 mL Supelclean ENVI-18、1 g/6 mL Supelclean ENVI-Carb（美國(guó)Supelco公司）。

本研究選擇的3種氧肟酸型鐵載體均購自美國(guó)Sigma公司：Ferrichrome（FC，無鐵絡(luò)合基，貨號(hào)F8014）、Ferrioxamine E（FO E，含鐵絡(luò)合物，貨號(hào)38266）、Pyoverdines-Fe（PVDs-Fe，含鐵絡(luò)合物，貨號(hào)P8374），其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式示于Sigma公司的產(chǎn)品說明書。FC和FO E呈環(huán)狀，是典型且常見的氧肟酸型鐵載體化合物； PVDs-Fe呈鏈狀，因其官能團(tuán)多樣，為混合型鐵載體化合物，既含氧肟酸官能團(tuán)，又有兒茶酚官能團(tuán)。3種鐵載體均以1∶1比例與Fe絡(luò)合。

2.2 溶液配制

鐵載體化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液： 超純水配制，濃度分別為PVDs-Fe，200 μg/mL； FC，500 μg/mL； FO E，200 μg/mL； 于

20℃下保存。使用時(shí)用超純水配制成所需濃度。低濃度： PVDs-Fe 0.01 μg/mL、FC 0.05 μg/mL、FO E 0.01 μg/mL； 中濃度： PVDs-Fe 0.10 μg/mL、FC 0.50 μg/mL、FO E 0.10 μg/mL； 高濃度： PVDs-Fe 1.00 μg/mL、FC 5.00 μg/mL、FO E 1.00 μg/mL。

含鐵載體化合物的人工海水： 取1～10 L超純水，用NaCl調(diào)節(jié)至所需鹽度，用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至所需pH值，向水樣中加入1 mL鐵載體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中各目標(biāo)物含量分別為 PVDs-Fe 3.00 μg/mL、FC 15.00 μg/mL、FO E 3.00 μg/mL。

2.3 樣品預(yù)處理

天然海水樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，

20℃保存，使用前解凍，人工海水樣品可不過濾。分別用5 mL甲醇、5 mL超純水活化ENVI-18固相萃取柱，以5 mL/min的流速使水樣通過萃取柱。用5 mL超純水預(yù)淋洗萃取柱，以4 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，將收集的洗脫液氮吹至近干（小于100 μL），用含0.1%（V/V）甲酸定容至1.00 mL，渦旋混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾，待測(cè)。

2.4 色譜和質(zhì)譜分析液相色譜參數(shù)： ZORBAX SB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司）； 進(jìn)樣量： 10 μL； 流動(dòng)相： A為0.1%（V/V）甲酸，B為甲醇； 流動(dòng)相流速： 0.25 mL/min； 梯度程序： 0～3 min，5% B； 3～18 min，5%～100% B； 18～20 min，100% B； 20～20.01 min，100%～5% B； 20.01～23 min，5% B。

質(zhì)譜參數(shù)： 電噴霧離子源（ESI）； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式； 毛細(xì)管電壓： 2886 V； 鞘氣溫度： 200℃； 鞘氣流速： 6 L/min； 干燥氣溫度： 300℃； 干燥氣流速： 10 L/min； 霧化氣壓力： 240.28 kPa； 噴嘴電壓： 1500 V； 碰撞氣為高純氮?dú)猓兌?gt;99.999%）。以ESI+模式，在m/z 100～1400范圍內(nèi)選擇合適的區(qū)間進(jìn)行全掃描，選擇準(zhǔn)分子離子峰； 再以準(zhǔn)分子離子峰作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇準(zhǔn)分子離子和兩個(gè)信號(hào)強(qiáng)度適宜的子離子作為監(jiān)測(cè)反應(yīng)的離子對(duì)。優(yōu)化后目標(biāo)物的質(zhì)譜分析參數(shù)列于表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)[9]表明，經(jīng)典的C18反向色譜法分離鐵絡(luò)合物時(shí)易形成拖尾峰，目標(biāo)物的出峰時(shí)間與溶劑峰接近或重合。選擇合適的流動(dòng)相可抑制拖尾。實(shí)驗(yàn)以3種鐵載體化合物的分離效果和信號(hào)強(qiáng)度為指標(biāo)，評(píng)估了4種流動(dòng)相： （1）甲醇-超純水、（2）甲醇-0.1%（V/V）甲酸、（3）乙腈-超純水、（4）乙腈-0.1%（V/V）甲酸。

結(jié)果表明，采用4種流動(dòng)相均可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分離。在流動(dòng)相中加入甲酸，鐵載體化合物的峰形及信號(hào)響應(yīng)得到明顯改善，而流動(dòng)相（2）的分離結(jié)果最優(yōu)。本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相（2），采用梯度洗脫模式。LC-MS/MS分析中常用的甲酸含量為0.1%（V/V），本實(shí)驗(yàn)未對(duì)流動(dòng)相中甲酸含量做進(jìn)一步研究。優(yōu)化后， PVDs-Fe，F(xiàn)C和FO E的保留時(shí)間分別為5.46，7.70和8.43 min。

3.2 固相萃取條件的優(yōu)化

天然海水樣品中鐵載體濃度低，需富集。近年來，固相萃取技術(shù)在樣品預(yù)處理領(lǐng)域運(yùn)用廣泛，McCormack等[9]用Isolute ENV+固相萃取柱，對(duì)人工及實(shí)際海水中鐵載體進(jìn)行萃??； 而后，該方法被沿用于海水中鐵載體的萃取[10，15～17]。但該方法的回收率不高，人工海水中的鐵載體化合物回收率為Fe-rhodotoluate，7.9%； Ferrioxamine，46%； FC，48%； 實(shí)際海水樣品中目標(biāo)物的回收率更低，F(xiàn)e-rhodotoluate，4.0%； Ferrioxamine，21%； FC，37%。

本研究系統(tǒng)考察了固相萃取柱（見2.1節(jié)）、洗脫溶劑中甲醇的比例（甲醇-超純水（V/V）： 0%， 30%， 50%， 80%和100%）、洗脫溶劑用量（1.00， 2.00， 3.00， 4.00和5.00 mL）、上樣體積（1.0， 3.0， 5.0， 8.0和10.0 mL）、鹽度（0‰， 15‰， 25‰， 35‰和40‰）、pH值（6.50， 7.00， 7.50， 8.00， 8.50）等參數(shù)對(duì)萃取結(jié)果的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選參數(shù)。實(shí)驗(yàn)采用六因素五水平25次實(shí)驗(yàn)，記為L(zhǎng)25（56），以各目標(biāo)物的回收率為評(píng)估依據(jù)，選出最優(yōu)固相萃取條件。

根據(jù)極差分析，6種因素中，對(duì)鐵載體化合物萃取回收率影響最大的是洗脫溶劑的比例。在正交實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，綜合3種目標(biāo)物回收率情況，選擇較好的萃取條件為： Supelclean ENVI-18柱萃取，4.00 mL 100%甲醇洗脫，上樣體積1.0 L，鹽度35‰，pH 7.00。在此條件下，回收率為PVDs-Fe 34.46%， FC 96.29%， FO E 86.11%。上樣體積對(duì)PVDs-Fe回收率的影響較大，而FC和FO E的回收率在水樣少于10 L時(shí)基本不變。本研究又對(duì)pH值進(jìn)行單因素考察，結(jié)果表明，在pH 7.02～8.52范圍內(nèi)，目標(biāo)物回收率基本持平。全球海洋表層海水鹽度大多介于33‰～37‰之間，表層水的pH值介于7.9～8.4之間[18]，故本方法可用于海水中鐵載體化合物的直接萃取，無需調(diào)節(jié)海水樣品的鹽度及pH值。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了LC-MS/MS分析的基質(zhì)效應(yīng)的影響。以廈門近岸海水為基底，按2.3節(jié)方法進(jìn)行過濾和預(yù)處理，氮吹濃縮至干，分別用高、低2個(gè)濃度水平的鐵載體化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解并定容。分析此溶液和用2.2節(jié)方法配制的相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)純水溶液，比較其響應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)=（海水樣品的信號(hào)響應(yīng)/純水樣品的信號(hào)響應(yīng)）×100%[19]?；|(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間表示效應(yīng)不明顯，高于120%為正效應(yīng)，反之為基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，本方法的基質(zhì)效應(yīng)在97.5%～124.4%范圍內(nèi)，僅低濃度FC的超出120%，表現(xiàn)出輕微正效應(yīng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用非基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析。

3.4 質(zhì)譜分析

實(shí)驗(yàn)以甲醇-水（50∶50，V/V）為載流，流速0.25 mL/min，不接色譜柱，單標(biāo)進(jìn)樣10 μL。在電噴霧電離過程中，3種目標(biāo)物所形成的主導(dǎo)離子均為質(zhì)子化的母體，且在ESI+模式下有較強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)，其中FC和FO E有[M+H]+和[M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰。PVDs-Fe為3種Pyoverdine的混合物，結(jié)合其分子量信息及質(zhì)譜圖可獲PVDs-Fe 的[M+2H]2+及[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰； 混合物中以含琥珀酸和琥珀酰胺的Pyoverdines為主要成分，含2-羥基戊二酰亞胺結(jié)構(gòu)的Pyoverdine為次要成分。將獲得的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，可分別獲得其碎片離子信息（圖1），用于鐵載體化合物譜圖的初步解析。本研究?jī)H對(duì)FC和FO E進(jìn)行MS2分析。

如圖1b所示， 后易脫H2O生成m/z 669.9的產(chǎn)物離子，豐度較大的碎片離子m/z 516可通過8-9和23-24兩處酰胺鍵的斷裂形成，經(jīng)過進(jìn)一步的斷裂（17-18位酰胺鍵）可得到m/z 344的碎片離子。FO E是Ferrioxamine族中僅有的兩個(gè)具有環(huán)形結(jié)構(gòu)（Ferrioxamine E和D2）的成員之一，其它Ferrioxamine均為鏈狀結(jié)構(gòu)[1]。鏈狀結(jié)構(gòu)的Ferrioxamines MS2譜中可觀察到因鏈末端脫-NH2或-NH3而產(chǎn)生的碎片離子峰[20，21]，而環(huán)狀結(jié)構(gòu)的Ferrioxamines MS2譜中可觀察到因脫H2O而產(chǎn)生的碎片離子，如FO E 產(chǎn)生的m/z 636。質(zhì)子化的FO E的質(zhì)譜圖文獻(xiàn)[21]報(bào)道過，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，但由于所用的檢測(cè)器不同，所得FO E的各碎片離子峰豐度略有差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)豐度較大的碎片離子進(jìn)行譜圖解析，見圖1d。 FO E的分子離子峰為m/z 654。 m/z 554來源于1位NO鍵的斷裂，1-2位NC鍵的斷裂及27-28位酰胺鍵的斷裂。m/z 554經(jīng)進(jìn)一步碎裂，丟失OH基團(tuán)后可得碎片離子m/z 537； m/z 470.7的產(chǎn)生則源于m/z 554碎片離子中C4H4O2的丟失。建立鐵載體譜庫是質(zhì)譜技術(shù)用于定性分析的重要條件。

3.5 工作曲線、檢出限和加標(biāo)回收率

配制0.001～15.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積定量，得到3種目標(biāo)物的線性方程及線性范圍。以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的添加水平為儀器檢出限（IDL），10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的添加水平作為定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

以廈門近岸海水為基底，按2.3節(jié)方法過濾后，分別向500 mL海水中加入低、中、高3個(gè)濃度水平的鐵載體化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL。每個(gè)濃度做4份平行，以標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法進(jìn)行定量分析，考察方法的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。3種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為PVDs-Fe 12.1%～18.6%，F(xiàn)C 82.0%～97.7%，F(xiàn)O E 70.0%～98.3%。PVDs-Fe的回收率較低，但該化合物的回收率為首次報(bào)道，與同類研究的其它鐵載體回收率[9]相比屬于常規(guī)水平，而FC和FO E的回收率均高于報(bào)道值[9，10]。3種目標(biāo)物回收率的RSD分別為PVDs-Fe 12.5%，F(xiàn)C 3.9%，F(xiàn)O E 8.9%。本方法對(duì)絡(luò)合態(tài)鐵載體化合物PVDs-Fe、FO E和非絡(luò)合鐵載體FC均具有良好的定性與定量分析能力。

3.6 實(shí)際海水樣品分析

運(yùn)用本方法測(cè)定廈門鼓浪嶼附近海水中鐵載體化合物含量。取樣量分別為1， 5和10 L，均未檢出鐵載體或類鐵載體化合物，這與近岸海水中鐵的濃度較高有關(guān)。本課題組對(duì)鄰近鼓浪嶼的九龍江河口海域的監(jiān)測(cè)結(jié)果[22]表明，該海域溶解態(tài)鐵含量為15.7～48.8 μg/L，此量級(jí)與可檢出鐵載體海域如新西蘭東南部沿海地區(qū)的溶解態(tài)鐵含量0.22～0.45 nmol/L [6]相比，屬較高水平，不足以構(gòu)成鐵脅迫，無法刺激生物分泌鐵載體。

4 結(jié) 論

建立了適用于海水基底中鐵載體及其鐵絡(luò)合物分離鑒定的固相萃取預(yù)處理、LC-MS/MS測(cè)定法。方法的基底分離效果好、富集倍數(shù)高，回收率良好，定量分析準(zhǔn)確； 利用質(zhì)譜技術(shù)還能對(duì)目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。本方法適合于高營(yíng)養(yǎng)鹽低葉綠素等鐵限制條件的海區(qū)中海水樣品的測(cè)定。

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