何　苗,張國利,陳　萍,田　園,岳玉環(huán),吳廣謀,于　佳,2,史　飛,2,侯天全

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春130118；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春130122；

3.吉林省人獸共患預防與控制重點實驗室 省部共建重點實驗室，吉林 長春130122)

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HSP65-PEAⅠ融合蛋白表達純化及免疫效果研究

何苗1,2,3,張國利2,3*,陳萍1,田園2,3,岳玉環(huán)2，3,吳廣謀2,3,于佳1,2,史飛1,2,侯天全2,3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春130118；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春130122；

3.吉林省人獸共患預防與控制重點實驗室 省部共建重點實驗室，吉林 長春130122)

摘要：目的通過基因工程手段在大腸桿菌中表達并純化融合蛋白HSP65-PEAⅠ，建立小鼠實驗模型，檢測其抗體效價水平，初步評價免疫效果。方法擴增HSP65-PEAⅠ片段插入表達載體pET-28a中，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導表達，優(yōu)化純化條件，以HSP65-PEAⅠ為免疫原對小鼠進行免疫接種。結(jié)果雙酶切和測序鑒定結(jié)果證實HSP65-PEAⅠ成功克隆入pET-28a載體中，表達的重組蛋白相對分子量約為97 000，主要以包涵體形式表達，純化后的重組蛋白純度達90%，濃度為0.498 mg/ml。免疫小鼠均在首免1周后采集的血清中檢測到特異性抗體，抗體效價水平持續(xù)增長且在42天均達到了210。結(jié)論成功在E.coli中表達并經(jīng)過純化得到重組蛋白HSP65-PEAⅠ，確定了動物免疫程序，為制備抗燒燙傷多器官衰竭疫苗奠定了基礎(chǔ)。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0700)

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)亦稱銅綠假單胞菌，是革蘭陰性桿菌,能夠運動[1]。廣泛存在于自然界中，綠膿桿菌能夠引起傷口感染，人的角膜炎和關(guān)節(jié)炎等[2]，其感染可使機體各個臟器組織病變，嚴重可致死。綠膿桿菌的毒素殘留還能引起食物中毒[3]。1973年Liu等[4]提出了其主要致病因子是綠膿桿菌外毒素A(PseudomonasaeruginosaexotoxinA,PEA)，并且約90%的臨床分離株能產(chǎn)生PEA。成熟PEA為613個氨基酸組成的多肽鏈，分子量約為66000，含有三個不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中區(qū)Ⅰ是氨基末端區(qū)(Ⅰa：第1-252位氨基酸和Ⅰb第365-404位氨基酸)，Ⅰa亞基與靶細胞結(jié)合實現(xiàn)毒素分子發(fā)揮毒性作用，Ⅰb亞基的功能尚未明確，即使有大部分缺失也不會影響PEA的生物活性；區(qū)Ⅱ是中央?yún)^(qū)(第253-364位氨基酸)含有6個連續(xù)α螺旋，有助于毒素跨膜轉(zhuǎn)位；區(qū)Ⅲ是羧基端區(qū)(第405-613位氨基酸)，行使細胞結(jié)合功能和ADP-核糖基化作用[5]。PEA的作用機理為毒素分子通過Ⅰa亞基與靶細胞表面特異性受體相結(jié)合，形成毒素-受體-膜復合物后進入細胞，ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶發(fā)生作用導致肽鏈延長被終止，蛋白合成受到抑制，最終細胞死亡[6]。PEA是燒燙傷患者綠膿桿菌感染后引起多器官衰竭的最大危害因素。

熱休克蛋白(heatshockprotein，HSP)是指生物在遭受高溫或其他應激產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì)。被認為是生物進化中比較保守的成分，不同種細胞產(chǎn)生的HSP分子序列絕大部分相同或類似[7]。在應激狀態(tài)下，HSP可防止其他蛋白質(zhì)發(fā)生變性或解聚，使其恢復活性，一般將HSP稱為分子伴侶[8]。目前已發(fā)現(xiàn)的HSP有10多種，主要的分為HSP90家族，HSP70家族，HSP60以及小分子亮HSP家族[9]。其中熱休克蛋白65屬于HSP60家族，主要參與蛋白質(zhì)的折疊、解折疊和組配，具有很強的免疫原性。在免疫中HSP通常可以作為佐劑、抗原和抗原載體，都能提高其免疫效果[10]。

本研究成功改造了重組基因HSP65-PEAⅠ，加入了HisTag標簽便于重組蛋白的純化。經(jīng)誘導表達純化最終得到了純度較高的重組蛋白，研究了動物免疫程序，進一步為預防和治療食源性綠膿桿菌感染、燒燙傷病人多器官衰竭綜合癥的研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　質(zhì)粒及菌種

pET-28a載體、質(zhì)粒pET-28a-HSP65-PEAⅠ(質(zhì)粒pET-28a-HSP65由吉林大學王麗穎教師惠贈)、E.coliJM109及E.coliBL21(DE3)均為軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所六室保存。

1.2　試驗動物

SPF級成年昆明鼠，購自長春生物制品研究所有限責任公司，動物合格證號：SCXKC(j)2011-003。

1.3　主要試劑

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NotⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL5000 均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)彩虹Marker購自北京全式金生物技術(shù)公司；卡那霉素購自寶泰克生物技術(shù)有限責任公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司；Chelating SepharoseTM Fast Flow，SephadexTMG-25 Fine，Q Sepharose High performance，DEAE Sepharose Fast Flow均購自美國GE公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；HRP 標記的羊抗鼠IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司；LB培養(yǎng)基(10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，定容到1 L，pH7.5)；ELISA：包被液(2.93 g NaHCO3，1.95 g Na2CO3，定容到1 L,pH9.6)；封閉液(3%奶粉， PBS溶液配制)；洗滌液(8.0 g NaCl，0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4·12H2O,0.2 g KCl,0.5 ml Tween-20,定容到1 L，pH7.4)；底物溶液(51.4 ml 0.1 mol/L 檸檬酸，48.6 ml 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O，兩者混合用時取100 ml，加40 mg 鄰苯二胺，30% H202);終止液(2 mol/L H2SO4)。

1.4　引物設(shè)計及合成

為使重組蛋白便于純化，在原有的重組質(zhì)?；A(chǔ)上添加了HisTag標簽，故委托寶生物工程(大連)有限公司合成引物：

上游:5’-CCAAGCTTCCAAGACAATTGCGTACGACGAAG-3’

下游:3’-GAGTGCGGCCGCTTAGTCGACCTGGTTCCACG-5’

1.5　目的片段擴增

以pET28a-HSP65-PEAⅠ質(zhì)粒為模版，PCR擴增目的基因片段。反應體系：dNTP mixture 2.0 μl；10×Buffer 2.0 μl；MgCl22.0 μl；酶0.2 μl；Template 1 μl；上下游引物各1 μl；無菌去離子水補足至25 μl。反應條件：95℃預變性5 min；94℃ 60 s、55℃ 80 s、72℃80 s，34個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃冷卻，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按試劑盒中使用說明書回收PCR產(chǎn)物。

1.6　重組質(zhì)粒pET28a- HSP65-PEAⅠ的構(gòu)建

用Hind Ⅲ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pET-28a，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因，以T4DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109，并涂布于含50 μg/ml Kan 的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化菌落，擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和NotⅠ雙酶切鑒定。陽性菌株質(zhì)粒委托寶生物工程(大連)有限公司，利用T7 promotor引物測序鑒定。

1.7　重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與重組蛋白表達

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3)，挑取陽性單菌落，轉(zhuǎn)接于含50 μg/mL Kan 的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液OD600約為0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，32℃誘導4 h后，取1 ml菌液超聲破碎(功率400 w，工作時間10 s，間歇20 s，共10 min)，4℃，10 000×g離心20 min，沉淀以1 ml 25 mmol/L 的Tris-Cl(pH7.5)重懸。分別取20 μl上清和沉淀重懸液進行12% SDS-PAGE分析。

1.8　重組蛋白的純化

1.8.1菌體發(fā)酵菌種經(jīng)在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)進行復蘇，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于含50 μg/ml Kan 的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液OD600約為0.5時，繼續(xù)轉(zhuǎn)接于1L LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液OD600約為0.5后，接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵參數(shù)為：滅菌溫度121℃，發(fā)酵溫度37℃，溶氧量30%，pH7.2，通氣量2.5 MVV，罐壓0.04 MPa。發(fā)酵過程當中加入：葡萄糖200 g/L，KH2PO43.0 g/L，補料培養(yǎng)基(蛋白胨48g，酵母粉 96 g，甘油32 ml，K2HPO4 65.5 g，定容至1 500 ml)，Antifoam 204 2 ml，Kan 1 g。發(fā)酵至OD600≈9.9降溫至30℃，加入誘導劑IPTG至終濃度1 mM，誘導5小時，當溶氧開始逐漸下降時，發(fā)酵結(jié)束，放罐4℃離心收集菌體。

1.8.2包涵體的洗滌、裂解以及復性取發(fā)酵菌10 g用100 ml 20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)重懸，超聲波破碎(功率1 200 W、工作時間10 S、間隔時間20 S、共60次)，鏡檢確定菌體破碎完全，4℃，12 000×g離心10 min，收集沉淀。沉淀用100 ml 2%Triton-×100和2M Urea 20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)依次充分洗滌后，4℃，12 000×g離心10 min，收集沉淀。用20 ml 8 M Urea 20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)重懸沉淀30℃裂解30 min，12 000×g離心10 min后收集上清，加入20 ml 20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)溶液，使Urea的終濃度為4M。依次用2L的3M Urea、2M Urea、1M Urea，20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)溶液于4℃透析復性，復性液中同時加入GSH和GSSG，比例為5∶1。透析后于4℃，12 000×g離心10 min，收集上清液用于進一步純化。

1.8.3重組蛋白HSP65-PEAⅠ層析純化取粗制樣品，進行Q Sepharose High performance陰離子交換層析(柱床體積為10 ml，柱型為XK16)，用20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)平衡約5倍柱床體積(流速：3 ml/min)，以1.0 ml/min流速上樣后，分別用20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，0.25 mmol/L、0.5 mmol/L NaCl 進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。收集的目的蛋白部分用SephadexTM G-25 Fine層析柱(柱床體積50 ml)脫鹽，脫鹽后的樣品進行金屬螯合層析(Cu2+)(柱床體積為10 ml，柱型為XK16)，用20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)平衡約5倍柱床體積(流速：3 ml/min)，以1.0 ml/min流速上樣后，分別用20 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，50、200 mmol/L咪唑進行階段洗脫，收集目的蛋白峰，進行12%SDS-PAGE分析，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.9　免疫實驗

將70只昆明小鼠隨機分成7組，每組雌雄各半，分別為A、B、C、D、E、F、G組。A組為生理鹽水對照組，皮下注射與免疫組相同體積的生理鹽水；B、C、D、E組HSP65-PEAⅠ免疫蛋白組，給予實驗鼠皮下注射免疫蛋白，其中B組免疫劑量為100 μg/只，C組免疫劑量為50 μg/只，D組免疫劑量為20 μg/只，E組免疫劑量為10 μg/只；F組為弗氏佐劑組，100 μg重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合；G組為鋁鹽佐劑組，100 μg重組蛋白與鋁鹽佐劑等體積混合。免疫共4次，每次免疫間隔14天。

1.10　抗體效價測定

在免疫的第7、14、21、28、35、49天，對七組實驗鼠分別進行尾靜脈取血，利用間接法ELISA測定抗體效價。用1 μg/ml的HSP65-PEAⅠ(100 μl/孔)包板，4℃過夜,洗滌3次，同時做空白陰性對照，每份樣品做復孔。2%的奶粉37℃封閉2 h，洗滌3次；加入梯度稀釋的被檢血清(100 μl/孔)，37℃孵育1 h，洗滌3次；加入1∶2 500的HRP 標記的羊抗鼠IgG(100 μl/孔)，37℃孵育1 h，洗滌3次；加入OPD顯色液(100 μl/孔)室溫避光20-30 min，然后加入終止液(50 μl/孔)，490 nm波長下測定OD值，OD490≥1即為陽性結(jié)果。

2結(jié)果

2.1　重組表達質(zhì)粒的鑒定

重組表達質(zhì)粒pET28a-HSP65-PEAⅠ的雙酶切(Hind Ⅲ/NotⅠ)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見2 500 bp的基因片段和pET-28a載體片段，見圖1。測序結(jié)果顯示，插入載體的基因片段與設(shè)計完全一致，未發(fā)現(xiàn)堿基突變或缺失等現(xiàn)象，表明HSP65-PEAⅠ基因片段以正確的閱讀框架克隆至表達載體pET-28a中。

1：Maker；2：重組表達質(zhì)粒pET28a-HSP65-PEAⅠ雙酶切后

2.2　層析純化結(jié)果

12%SDS-PAGE分析顯示，粗制樣品經(jīng)陰離子交換層析和金屬螯合層析后最終得到了較純的目的蛋白，純度達90%以上，見圖2。得出樣品蛋白濃度為0.498 mg/ml，蛋白收率為4.2 mg/g濕菌。

2.3　抗體滴度結(jié)果

間接ELISA法測定免疫第7、14、21、28、35、49天小鼠血清的抗體效價，見圖3。測定結(jié)果顯示，在免疫一周后效價水平開始持續(xù)增長，并且在免疫42天蛋白免疫組抗體效價均達到了210，佐劑免疫組明顯高于蛋白免疫組，其中鋁鹽佐劑組免疫效果尤為顯著，效價水平達到了216，弗氏佐劑組略微低達到了215。

M:蛋白質(zhì)Marker；1:Q層析后樣品；2:金屬螯合層析后樣品

圖3　抗體滴度曲線

3討論

本實驗將重組基因HSP65-PEAⅠ克隆到pET-28a載體中，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-28a- HSP65-PEAⅠ，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后，經(jīng)誘導表達，蛋白在細菌的胞內(nèi)以不可溶形式表達。由于重組蛋白相對分子量較大不利于純化，所以設(shè)計增加了組氨酸標簽，使得重組蛋白能與金屬螯合層析介質(zhì)相結(jié)合，提高了重組蛋白的純化效率和純度。包涵體經(jīng)2%Triton-×100和2M Urea洗滌后，透析復性后，經(jīng)Q Sepharose High performance陰離子交換層析、SephadexTM G-25 Fine層析柱和金屬螯合層析(Cu2+)，獲得純度達90%以上的HSP65-PEAⅠ。

PEA受體結(jié)合亞基的高度保守性能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生針對多血清的PEA抗體，熱休克蛋白的免疫提呈增強、免疫原復性，體內(nèi)蛋白保護，抗炎癥擴散等作用刺激機體產(chǎn)生高效價抗體。本研究利用了PEAⅠ的高度保守性和HSP65的分子伴侶作用，制備的特異性抗PEA的免疫制劑，具有一體雙效的作用。免疫試驗結(jié)果顯示注射疫苗7 d后即可檢測到抗體，隨著免疫時間延長抗體滴度呈現(xiàn)明顯上升趨勢，在免疫的第42天無佐劑組都達到了210，佐劑組達到了215，說明疫苗對綠膿毒素表現(xiàn)出較強的免疫保護性，在生產(chǎn)實踐中具有十分廣闊的應用前景，且該疫苗在動物免疫攻毒試驗中繼續(xù)做深入研究，為進一步開發(fā)應用于臨床的抗綠膿桿菌感染的免疫制劑奠定堅實基礎(chǔ)。

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關(guān)鍵詞：熱休克蛋白65；綠膿桿菌外毒素A；基因克隆；表達；純化

Study on the expression,purification and immune efficacy of fusion protein HSP65-PEA ⅠHEMiao，ZHANGGuo-li，CHENPing，etal.(CollegeofFoodScienceandEngineering，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Abstract:ObjectiveExpress protein HSP65-PEAⅠin E.coli and obtain purified protein，establish mice model,preliminary evaluate the immune efficacy by detecting antibody titer levels.MethodsAmplify HSP65-PEAⅠand then inserted into expression vector pET-28a,transformE.coliBL21(DE3),express with the induction of IPTG,optimize the purification condition,then the protein was inoculated in mice as immunogen.ResultsDouble digestion and sequencing results proved that the HSP65-PEAⅠgene was cloned into vector pET-28a,the relative molecular mass of expressed recombinant protein was about 97000,mainly expressed as inclusion body.After purification,purity of recombinant protein was more than 90%,concentration was 0.498 mg/ml.The specific antibody was detected in the serum of mice in the first week after immunization,the titer level continued growing and rise to 210after 42 days.ConclusionRecombinant protein HSP65-PEAⅠwas successfully expressed inE.coliand purified.Animal immunization program was further established which laid a foundation for preparation of vaccine for multiple organ failure by burns.

Key words:HSP65;PEAⅠ;Gene clone;Expression;Purification

(收稿日期：2014-05-18)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R392

文章編號：1007-4287(2015)05-0700-05

*通訊作者

基金項目:軍隊后勤科研項目(CWS11J091)