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miRNA在HPV相關(guān)腫瘤組織中的表達對比研究

丁建龍1,吳文安2，孟凡旭3,鄧萍3*

(1.陜西省漢中市3201醫(yī)院 普外科，陜西 漢中723000；2.陜西省腫瘤醫(yī)院 放療科，陜西 西安710061；

3.吉林省腫瘤醫(yī)院 婦瘤放療科，吉林 長春130012)

人乳頭瘤病毒(HPV)通過表達病毒癌基因，干擾機體正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子活化及擾亂有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答形成了癌癥發(fā)病的確切因素，但此過程需要經(jīng)歷長期且極其復(fù)雜的系列分子事件和多種編碼基因與非編碼基因的參與，并且在不同的感染部位，致癌的幾率和病理過程差異很大[1，2]；近年來,隨著微小RNA(miRNA)的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的逐漸發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程的角色正成為基因調(diào)控領(lǐng)域的熱點；目前已經(jīng)明確許多miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過程有表達水平的變化，并參與到病毒感染性疾病中與病毒的感染、清除、復(fù)制等過程，但miRNA是否參與HPV感染細(xì)胞免疫逃逸調(diào)控以及發(fā)揮的作用尚無定論。本研究應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)檢測與HPV感染密切相關(guān)的宮頸癌、外陰癌和肛門癌中的miR21、miR29、miR31、miR101、miR143、miR126 、miR146和 miR155的表達量，并對比瘤體組織與癌旁正常組織中的表達差別，初步探討HPV病毒感染致癌病理過程中不同miRNA的表達變化。

1材料與方法

1.1一般資料隨機入組患者，簽署知情同意書，收集門診臨床診斷為CA的組織樣本，標(biāo)本隨即存放于高壓滅菌的凍存管保存于液氮中。同時取洗體脫落細(xì)胞送檢進行HPV雜交分型鑒定。收集和填寫相關(guān)臨床資料,包括性別、年齡、發(fā)病部位、病程、初發(fā)/復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)次數(shù)和基礎(chǔ)疾病等信息。

1.2標(biāo)本收集與處理①標(biāo)本收集：收集本院婦外科、肛直腸外科2010年6月至2013年6月婦女子宮頸鱗癌30例、外陰鱗癌5例、肛門鱗癌2例；取樣前均未經(jīng)放療、化療、免疫治療等治療手段干預(yù)。年齡33~63歲，平均(47.26±7.32)歲。

②miRNA提取：提取和擴增應(yīng)用miRNA提取試劑盒(Takara公司)抽提各組組織中的總mRNA。各個miRNA的特異性引物購自Takara公司。PCR擴增采用熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為5 μl，反應(yīng)條件為42℃ 60 min，70℃15 min， 4℃維持，將得到的5 μl cDNA加入20 μl熒光定量反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為預(yù)變性50℃ 2 min，95℃ 2 min，95 ℃15 s， 60 ℃30 s，72 ℃ 30 s； 40個PCR 循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光值，各樣本檢測重復(fù)3孔。以U6為內(nèi)參照，利用其ΔCt值進行相對定量。即用同組中每個樣本目的基因的Ct值減去的U6的Ct值得到ΔCt,再用觀察組中目的基因的ΔCt減去對照組的△Ct得到ΔΔCt值，代入公式2-ΔΔCt計算即得到目的基因觀察組/對照組的值，以對照組目的基因的值為1，計算各實驗組miRNA的含量。

2結(jié)果

癌組織中miR15b、miR21、miR155表達量高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-145、miR34a、miR143、miR218表達量低于癌旁正常組，宮頸癌組miR145、miR218；外陰、肛門癌組miR143與癌旁組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR146a僅在宮頸癌組顯示出了明顯的增高趨勢，而外陰、肛門癌組miR146a未見明顯的表達變化，且兩癌性組組間表現(xiàn)出明顯的差異(P<0.05)。miR218的表達明顯降低，尤其在宮頸癌組更為顯著，且宮頸癌組與外陰、肛門癌組組間表現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)。見表1。

3討論

HPV感染與宮頸癌、外陰癌、肛門癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)聯(lián)，宿主受到高危亞型HPV感染后，其會整合宿主染色體，通過癌蛋白影響抑癌蛋白的活性，使其失活從而引起癌癥的發(fā)生。但三種疾病的發(fā)病率有著巨大的差異，在發(fā)病率相對較高的宮頸癌患者中，也僅是由大約2%的HPV感染患者轉(zhuǎn)變而來；而外陰癌和肛門癌更為罕見。這異味著一些重要的扳機點在病毒致癌的病理過程中起到關(guān)鍵作用，而miRNA是重要的研究方向。

GroupmiR15bmiR21miR146amiR155miR145miR34amiR143miR218宮頸癌1.32±0.47*2.16±0.79*3.17±0.66*1.03±0.570.34±0.16*0.44±0.070.33±0.110.26±0.05*宮頸癌癌旁11111111外陰、肛門癌0.99±0.32*1.67±0.17*0.98±0.24△0.86±0.320.45±0.060.32±0.120.20±0.01*0.52±0.08△外陰、肛門癌癌旁11111111

*vs癌旁P<0.05,△vs宮頸癌P<0.05

目前關(guān)于HPV與miRNA之間的相關(guān)性還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識，本實驗的結(jié)果顯示，在宮頸癌、外陰、肛門癌癌組織中miR15b、miR21表達量高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這意味著所檢測的具有原癌基因特性的微小RNA，可能在HPV感染致癌過程中發(fā)揮了作用；而值得注意的是，miR146a并沒有在外陰、肛門癌組織中表達增高，這意味著miR146a可能具有宮頸癌特異性，且與HPV感染相關(guān)性較弱。目前關(guān)于miR-146a在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存爭議，且miR-146a在不同類型腫瘤組織中的表達存在差異。研究表明子宮頸癌、Burkitts淋巴瘤等中其過表達，而miR-146a在前列腺癌等腫瘤組織中表達程下降趨勢[3-6]。目前認(rèn)為miR-146a靶基因較為復(fù)雜，包括了p53等抑癌基因及kit癌基因等。本實驗結(jié)果標(biāo)明其可能具有宮頸癌特異性，這可能由于miR-146a的靶基因是核因子κB依賴基因[7]。miR146a能否成為指示宮頸癌病理過程的特異性生物標(biāo)志物，有待于進一步的深入探索。miR-21位于染色體脆弱區(qū)域，與HPV與宿主整合DNA的區(qū)域重合[8]，可能對腫瘤的發(fā)生有重要作用。

目前miR-145、miR34a、miR143、miR218均被認(rèn)為是抑癌基因[9-11],但其與HPV感染的關(guān)系尚未明確。本實驗中，在宮頸癌、外陰、肛門癌癌組織中miR-145、miR34a、miR143、miR218表達量低于癌旁正常組織，其中宮頸癌組miR145、miR218；外陰、肛門癌組miR143與癌旁組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在HPV感染致癌過程中體現(xiàn)出了抑癌基因的功能。而miR218的表達明顯降低，尤其在宮頸癌組更為顯著，且宮頸癌組與外陰、肛門癌組間間表現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)，這可能和HPV亞型相關(guān)，可能是不同亞型病毒miRNA相互作用的結(jié)果。而miR34a、miR143在兩組癌組織中表達量并沒有顯示出差異，可能其與HPV感染關(guān)系較弱[12，13]。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，HPV與宿主染色體的整合及相關(guān)miRNA在其中的調(diào)控作用的失衡，是細(xì)胞癌變過程的重要步驟。本文中三種疾病有著完全不同的發(fā)病過程及發(fā)病率，這也預(yù)示著癌癥的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷了不同的分子機制及調(diào)控過程，而這一過程的深入探索，可能得到HPV致癌機理，并進一步讓獲取靶向性的癌癥的發(fā)生發(fā)展的分子阻遏位點成為可能，并可通過借助于表達差異對腫瘤及其分化轉(zhuǎn)歸情況進行診斷、預(yù)測，針對性的進行反義阻抑或表觀治療，或者成為腫瘤患者預(yù)后的評估指標(biāo)。

參考文獻：

[1]Au Yeung CL,Tsang TY,Yau PL,et al.Human papillomavirus type 16 E6 induces cervical cancer cell migration through the p53/micro-RNA-23b/urokinase-type plasminogen activator pathway[J].Oncogene,2011,30(21):2401.

[2]Myklebust MP,Bruland O,Fluge O,et al.MicroRNA-15b is induced with E2F-controlled genes in HPV-related cancer[J].Br J Cancer,2011,105(11):1719.

[3]Igoucheva O,Alexeev V.MicroRNA-dependentregulationofcKitincutaneousmelanoma[J].Biochem Biophys Res Common,2009,379(3):790.

[4]Felicetti F,Errico MC,Bottero L,et al.Thepromyelocy ticleukemiazincfinger-microRNA-221/-222 pathway control smelanomapro-gression through multipleon cogenicme chanisms[J].Cancer Res,2008,68(8):2745.

[5]Lin SL,Chiang A,Chang D,et al.Loss of miR-146 function in hormone-refractory prostate cancer[J].RNA,2008,14(3):417.

[6]LI Y,Vandenboom TG,Wang Z,et al.miR-146 asuppressesin vasion of pancreatic cancer cells[J].Cancer Res,2010,70(4):1486.

[7]Cameron JE,Yin Q,Fewell C,et al.Epstein-Barrvirus latentmem-brane protein induces cellular Micro RNAmiR-146a,amodulatorofly mphocyte signaling pathways[J].Virol,2008,82(4):1946.

[8]Cheng AM,Byrom MW,Shelton J,et al.Antisense inhibitionofhuman miRNA sandindications for aninvolvement of miRNA incellgrowth and apoptosis[J].Nucleic Acids Res,2005,33(4):1290.

[9]Lui WO,Pourman DN,Patterson BK,et al.Pattern sofknownandnovel small RNA sinhuman cervical cancer[J].Cancer Res,2007,67(13):6031.

[10]Wang X,Tang S,Le SY,et al.Aberrantexpressionofoncogenicandtumor-suppressivemicro RNA sincervicalcancerisrequiredforcancercellgrowth[J].PLoS One,2008,3(7):2557.

[11]Martinez I,Gardiner AS,Board KF,et al.Human papillomavirus type 16reduces the expression of microRNA-218 in cervicalcarci-nomacells[J].Oncogene,2008,27(18):2575.

[12]Martinez I,Gardiner AS,Board KF,et al.Human papillomavirus type 16reduces the expression of microRNA-218 in cervicalcarci-nomacells[J].Oncogene,2008,27(18):2575.

[13]Wang X,Wang HK,McCoy JP,et al.Oncogenic HPV in fection interruptsthee xpression of tumor-suppressive miR-34 at hrough viralonco protein E6[J].RNA,2009,15(4):637.

(收稿日期：2014-09-11)

文章編號：1007-4287(2015)05-0803-03

*通訊作者