左 松， 伍時華， 張 健， 趙東玲， 黃翠姬

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

在全球能源危機(jī)的影響下，原本用于生產(chǎn)白糖的甘蔗被巴西等國大規(guī)模應(yīng)用于酒精生產(chǎn)[1]。甘蔗汁中可發(fā)酵性糖主要為蔗糖，在酒精發(fā)酵過程中，一分子蔗糖被水解為一分子果糖和一分子葡萄糖，果糖和葡萄糖共用一套膜運(yùn)輸和酶催化體系[2]，但葡萄糖對膜運(yùn)輸和酶的親和力均大于果糖，因而酵母往往優(yōu)先利用葡萄糖，使得果糖成為發(fā)酵后期主要?dú)執(zhí)牵藭r發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和乙醇含量高使得果糖代謝緩慢甚至停滯，導(dǎo)致發(fā)酵時間延長。然而，上述現(xiàn)象并不固定，果糖和葡萄糖利用的差異性除了與菌種的基因背景有關(guān)[2]，還易受外部因素如溫度[3]、果糖與葡萄糖比例[4]和可同化氮源[5]等的影響。目前，甘蔗汁發(fā)酵過程中果糖和葡萄糖利用的差異性受外源乙醇影響的研究還未見報道，因此針對此問題開展研究很有必要。

為了避免蔗糖水解過程對研究進(jìn)程和結(jié)果的影響，故以YPDF（Yeast Extract Peptone Dextrose Fructose）培養(yǎng)基模擬甘蔗汁進(jìn)行酵母GJ2008等濃度果糖與葡萄糖混合發(fā)酵，研究過程中果糖與葡萄糖利用及其酒精發(fā)酵過程受外源乙醇的影響，從而為甘蔗汁酒精發(fā)酵工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

酒精酵母 GJ2008 （Saccharomyces cerevisiae），為甘蔗汁酒精發(fā)酵高產(chǎn)菌株，由廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，瓊脂20 g/L。一級種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母浸膏10 g/L；自然pH。二級種子培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L；自然pH。YEP溶液：蛋白胨40 g/dL，酵母浸膏20 g/dL。以上培養(yǎng)基和溶液均在115℃下高壓蒸汽滅菌30 min。

YPDF培養(yǎng)基：無菌水配制乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為0%、6%、9%和12%，取180 mL加入500 mL的錐形瓶中，后加入YEP溶液10 mL，加入食品級果糖與葡萄糖調(diào)節(jié)果糖與葡萄糖質(zhì)量濃度分別為（47.36±1.29） g/L 和（44.15±1.11） g/L。

1.3 發(fā)酵方法

將實(shí)驗(yàn)室保存菌種接至斜面活化培養(yǎng)基上，30℃條件活化培養(yǎng)1～2 d，待其斜面上長出白色菌落，即菌種培養(yǎng)成熟。將已活化的斜面種子轉(zhuǎn)接至一級種子培養(yǎng)基中，32℃，搖床120 r/min，培養(yǎng)12 h后以體積分?jǐn)?shù)10%接種量轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基中，32℃，搖床120 r/min，培養(yǎng)10 h后離心棄上清液，濕酵母泥備用。將濕酵母泥（以體積分?jǐn)?shù)50%接種量）轉(zhuǎn)接至200 mL YPDF發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL的錐形瓶）進(jìn)行果糖與葡萄糖混合發(fā)酵，初始酵母數(shù)為 1.12×108個/mL，28 ℃，搖床 120 r/min培養(yǎng)，每份2個平行，測定結(jié)果取平均值。發(fā)酵過程中每隔4 h取樣并測CO2失重，至CO2失重小于0.2 g時，即發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)條件為非嚴(yán)格厭氧，用透氣封口膜和牛皮紙包扎批式發(fā)酵。

1.4 分析方法

果糖和葡萄糖的測定采用高效液相色譜法，其色譜參數(shù)為：流動相為V（色譜純乙腈）∶V（二次蒸餾水）=80∶20，體積流量 1 mL/min，柱溫 30 ℃。 蒸發(fā)光散射檢測器 （evaporative light scattering detector，ELSD）參數(shù)：漂移管溫度95℃，空氣體積流量2.0 L/min。生物量的測定：取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心2 min，上清液-60℃冷凍（用以測糖質(zhì)量濃度和乙醇體積分?jǐn)?shù)），無菌水洗滌酵母泥并離心棄上清液，酵母泥在80℃烘箱烘干至恒質(zhì)量；酒精度采用生物傳感分析儀SBA-40C測定：標(biāo)準(zhǔn)乙醇體積分?jǐn)?shù)0.075%，發(fā)酵上清液稀釋至合適濃度進(jìn)樣分析。

1.5 糖代謝曲線分析

果糖和葡萄糖的代謝曲線運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行繪制，并分別獲得果糖與葡萄糖代謝曲線下面積（Area under the fermentation curve/AUC），記做果糖AUC和葡萄糖AUC。

2 結(jié)果與討論

2.1 外源乙醇對糖代謝的影響

外源乙醇對酵母GJ2008葡萄糖和果糖利用有較大的影響。在不同體積分?jǐn)?shù)外源乙醇條件下，酵母GJ2008果糖和葡萄糖代謝曲線見圖1，由圖1（a）（b）可知，酵母GJ2008均對葡萄糖優(yōu)先利用，果糖的利用一直滯后于葡萄糖。外源乙醇加入后，酵母的活力受到了抑制，果糖和葡萄糖的利用速率均有所降低。在外源乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時，葡萄糖消耗幾乎不受其影響，而果糖消耗完全時間明顯延長。Berthels等指出，乙醇會使得果糖的構(gòu)型由β-吡喃型向β-呋喃型轉(zhuǎn)變，吡喃型的果糖能被酵母所直接運(yùn)輸并利用，而呋喃型則不可以[5]，因此上述現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與乙醇對果糖構(gòu)型的轉(zhuǎn)變有關(guān)。在外源乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)12%時，果糖和葡萄糖的利用均明顯放緩，酵母GJ2008在時間段12～24 h明顯偏用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)葡萄糖含量降至0 g/L時，果糖由降解緩慢變?yōu)槊黠@加快，可解釋為葡萄糖的膜運(yùn)輸體系和膜競爭性抑制得到解除（單糖發(fā)酵表明GJ2008果糖和葡萄糖利用速率相當(dāng)），酵母周圍環(huán)境果糖較多，果糖運(yùn)輸?shù)臋C(jī)會增加，從而果糖的利用加快。

圖1 外源乙醇條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖消耗曲線Fig.1 Profiles of fructose and glucose concentrations duringtheethanolfermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 at different external ethanol contents ranging from 0%～12%

Liccioli用 YPF（Yeast Extract Peptone Fructose）培養(yǎng)基成功篩選出具有較高果糖發(fā)酵能力的酵母菌，但酵母菌回至果糖與葡萄糖混合發(fā)酵時，果糖的利用速率并不比一般的釀酒酵母快。表明混合發(fā)酵時葡萄糖代謝調(diào)控作用很大程度上影響了果糖的代謝[6]。因此，外源乙醇添加組與對照組相比，外源乙醇的加入使得葡萄糖的利用速率降低，葡萄糖代謝調(diào)控作用得不到及時解除，進(jìn)而可能間接地影響了果糖的代謝。

2.2 外源乙醇對糖利用面積的影響

曲線下面積法可以整體地評價發(fā)酵的好壞[7]，這些數(shù)據(jù)可以直接從GraphPad Prism 5軟件數(shù)據(jù)分析中獲得。從表1可知，在不同體積分?jǐn)?shù)外源乙醇條件下，葡萄糖AUC總是小于果糖AUC，表明酵母GJ2008對葡萄糖有著明顯的偏好，證實(shí)了酒精酵母對葡萄糖的嗜好性。在外源乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%和9%時，果糖AUC和葡萄糖AUC的比值相同，說明酵母GJ2008可耐受較高體積分?jǐn)?shù)的外源乙醇。表2中外源乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度下果糖AUC/果糖AUC和葡萄糖AUC/葡萄糖AUC的比較表明了酵母GJ2008利用果糖和葡萄糖受到外源乙醇梯度影響的程度，前者均大于后者，可以說明果糖的代謝更易受到外源乙醇的影響。

表1 外源乙醇條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖代謝曲線面積Table 1 Area under the fructose and glucose utilization curves for fermentations by S.cerevisiae GJ2008 of media containing equal glucose and fructose to total concentration of 90 g/L

Zinnia等以葡萄糖和果糖進(jìn)行單糖酒精發(fā)酵，探討了外源乙醇的添加對葡萄糖和果糖消耗的影響。結(jié)果表明：未添加外源乙醇時，果糖和葡萄糖消耗過程幾乎沒有差別；添加外源乙醇后，發(fā)酵后期果糖和葡萄糖利用均停滯，但果糖消耗受抑制程度明顯高于葡萄糖的[8]。單糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)也表明，酵母GJ2008果糖與葡萄糖利用速率相當(dāng)（結(jié)果未給出），因此不論是單糖發(fā)酵還是混合糖發(fā)酵，與葡萄糖代謝相比較，果糖代謝似乎均更易受到外源乙醇的影響。

2.3 外源乙醇對dGF/dG值的影響

dGF/dG=[dG-dF]/dG即[單位時間內(nèi)葡萄糖消耗量（dG）-單位時間內(nèi)果糖消耗量（dF）]/單位時間內(nèi)葡萄糖消耗量（dG），dGF/dG值作為衡量果糖與葡萄糖利用差異性的指標(biāo)[5]，該值在發(fā)酵過程的變化情況見圖2。

圖2 外源乙醇條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵dGF/dG值變化曲線Fig.2 Profiles ofdGF/dGvalue during the ethanol fermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 at different external ethanol contents ranging from 0%～12%

由圖2可知，外源乙醇對果糖與葡萄糖利用差異性影響明顯，隨著外源乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，果糖與葡萄糖利用差異性逐漸拉大，至外源乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時，dGF/dG值一直維持在較高水平，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)12%左右已經(jīng)非常不利于果糖與葡萄糖利用差異性的縮小。

2.4 外源乙醇對細(xì)胞生成和乙醇合成的影響

在不同體積分?jǐn)?shù)外源乙醇條件下，酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵酵母干質(zhì)量和乙醇生成曲線見圖 3，從圖 3（a）（b）可以看出，外源乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%～12%，與對照組相比，細(xì)胞生長和乙醇生成明顯受到抑制，發(fā)酵時間明顯延長，且最終酵母數(shù)維持值和乙醇合成量均有不同程度降低。結(jié)合圖1（a）（b）可知，雖然酵母對果糖與葡萄糖的利用量基本一致，但最終細(xì)胞生成量和乙醇合成量均明顯減少，原因可能是在較高體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下，酵母消耗部分糖用以合成如海藻糖類的物質(zhì)，從而抵御乙醇對細(xì)胞的毒害作用[9]。

圖3 外源乙醇條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵細(xì)胞生成和酒精生成曲線Fig.3 Profilesofbiomassproduction and ethanol accumulation during the ethanol fermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 at different external ethanol contents ranging from 0%to 12%

糖的利用與細(xì)胞的生成和乙醇的積累關(guān)系密切，結(jié)合圖 1（a）（b）和圖 3（a）可知，加入外源乙醇組與對照組對比表明，外源乙醇的加入不利于果糖與葡萄糖的消耗，且果糖利用受抑制程度較大，但不能得出乙醇的加入對果糖利用的抑制作用更強(qiáng)，因?yàn)橐掖技尤牒?，生物量的合成和葡萄糖的利用均有所抑制，此種抑制作用對果糖的代謝似乎有著消極的影響；體積分?jǐn)?shù)6%外源乙醇組與體積分?jǐn)?shù)9%外源乙醇組在0～4 h內(nèi)生物量基本相同，后者果糖與葡萄糖利用受抑制程度分別要高于前者4.99%和13.23%，表明發(fā)酵初期葡萄糖的代謝較果糖更易受到外源乙醇的影響，結(jié)論與Berthels研究一致[5]；其它發(fā)酵時間段，由于生物量的不同，因而不能進(jìn)行有效分析。

3 結(jié)語

外源乙醇的加入影響了果糖與葡萄糖的利用、細(xì)胞的合成和乙醇的生成，果糖與葡萄糖的利用與細(xì)胞的合成以及乙醇的生成三者關(guān)系密切，三者彼此影響和作用，干擾果糖與葡萄糖利用的差異性受外源乙醇的影響。本試驗(yàn)中用YPDF模擬甘蔗汁，以體積分?jǐn)?shù)50%酵母接種量避免細(xì)胞生長影響酒精發(fā)酵，并運(yùn)用曲線下面積法從整體上評估外源乙醇的加入對果糖與葡萄糖的利用差異性的影響程度，結(jié)果可信度較高。

在不同體積分?jǐn)?shù)外源乙醇條件下，酵母GJ2008等質(zhì)量濃度果糖和葡萄糖混合發(fā)酵表明：發(fā)酵初期，外源乙醇對葡萄糖代謝的影響要大于對果糖代謝的影響，但就整個發(fā)酵周期而言，外源乙醇對果糖代謝的影響程度明顯要高于對葡萄糖的，外源乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)6%以上時，糖轉(zhuǎn)化乙醇產(chǎn)量減少了19%～27%。

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