高 原， 陸震鳴， 李 恒， 錢建瑛， 史勁松， 許正宏

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

蛤類海產(chǎn)在我國沿海潮帶間分布廣泛，是我國海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟貝類之一[1-2]。文蛤（Meretrix lusoria L.）是蛤中上品，素有“天下第一鮮”之稱，不但肉質(zhì)鮮美可口，而且營養(yǎng)價值高，含有大量氨基酸、糖元、?；撬岷突钚晕⒘吭?，是海洋生物中的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[3]。

近年來，隨著人民生活水平的提高和餐旅業(yè)的發(fā)展，人們對調(diào)味品的要求也越來越高了，不僅要求色、香、味俱全，并且隨著營養(yǎng)和保健意識的增強，還要求其具有更高的營養(yǎng)價值和更多的保健成分[4]。以新鮮文蛤肉為原料，采用生物酶工程技術(shù)，制得其蛋白水解液或濃縮浸膏等，可用作調(diào)味品或食品的配料，這種文蛤食品香料在現(xiàn)代食品加工業(yè)有著極其重要的利用價值。楊晉等以文蛤肉為原料，利用多種蛋白酶進行水解，并通過正交實驗確定了最佳酶解條件，文蛤蛋白水解度達到35.8%，總氮回收率為51.2%[5]。張?zhí)淼炔捎靡鹊鞍酌负椭行缘鞍酌笍?fù)合水解新鮮文蛤肉，并利用水解產(chǎn)物制備了文蛤調(diào)味醬[6]。上述研究均以蛋白質(zhì)的水解度為指標進行復(fù)合酶解工藝的優(yōu)化。

作者采用綜合評分為指標，比較6種不同蛋白酶對文蛤肉水解的效果，并對篩選獲得的蛋白酶水解的工藝參數(shù)進行正交試驗優(yōu)化，制備出蛤類特征風(fēng)味突出、腥味較弱的咸味香精。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

新鮮文蛤，江蘇省如東縣生態(tài)文蛤養(yǎng)殖基地提供；中性蛋白酶、酸性蛋白酶，江蘇省博立生物科技有限公司生產(chǎn)；木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)；風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶Alcalase 2.4L，諾維信中國投資有限公司生產(chǎn)；其余試劑均為食品級。

Diamonsil（鉆石一代）C18型分析色譜柱，組織搗碎勻漿機，集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋，高速離心機，紫外-可見分光光度計等。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶水解工藝流程 新鮮文蛤于淡鹽水吐沙6 h，然后置于沸水浴中約1.0 min至微開殼，取蛤肉。按蛤肉質(zhì)量比1∶4加水，用組織搗碎機進行均漿，先在55～65℃熱處理20 min，再升溫至95～105℃熱處理10 min，冷卻至45～55℃。自然pH下加酶，恒溫攪拌水解，反應(yīng)結(jié)束后將水解液煮沸10 min以滅酶，在4 000 r/min、4℃下離心30 min，取上清液放入冰箱-20℃冷凍保藏。

1.2.2 文蛤肉酶解工藝條件的正交優(yōu)化 采用兩段法進行文蛤肉的復(fù)合酶解：一段酶解采用復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶進行水解，加酶總量設(shè)置為一定量（如150 U/g），pH自然；二段酶解選用風(fēng)味蛋白酶進行水解，pH自然，溫度為50℃。一段酶解和二段酶解的總時間為4 h。酶解結(jié)束后滅酶，冷卻至室溫后進行感官評價，并分別測定水解度和水解得率，對上述3個指標進行加權(quán)平均得到綜合評分。

采用四因素三水平的正交實驗設(shè)計，見表1?？疾煲蛩?A（m（復(fù)合蛋白酶）∶m（中性蛋白酶））、因素B（一段酶解溫度）、因素 C（風(fēng)味蛋白酶）、因素 D（一段酶解和二段酶解的時間比）對文蛤肉水解效果的影響，優(yōu)化二段法復(fù)合酶解工藝條件。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

1.2.3 總氮量、氨基氮含量、水解度和水解得率的測定 總氮量的測定參照國標GB5009.5-2010中凱氏定氮法進行[7]。

取文蛤肉水解液5.0 mL置于小燒杯中，然后加入60.0 mL放冷的去CO2水，攪拌后用0.1 moL/L標準NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入甲醛溶液20 mL（甲醛溶液每次使用之前都要調(diào)到pH 7.0），然后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH 9.2，記錄消耗的NaOH溶液體積，并根據(jù)下述水解度公式計算氨基氮含量（g/mL）[2]。

1.2.4 蛋白酶活力的測定 蛋白酶活力的測定參照行標SB/T10317-1999中福林酚法進行。

1.2.5 感官評價方法 由8人組成感官評價小組，分別對文蛤肉水解液的色澤、氣味、滋味進行評價（表2）。同時對水解液的風(fēng)味和口感進行綜合打分，分值最低為0分，最高為6分。

1.2.6 多肽濃度的測定 取5.0 mL文蛤肉離心上清液，加入5.0 mL質(zhì)量分數(shù)15%TCA水溶液，混勻后靜置10 min，4 000 r/min離心10 min，上清液稀釋至1～l0 g/L的溶液，取稀釋液1 mL加入4 mL雙縮脈試劑，混勻靜置30 min。同時以1 mL水和4 mL雙縮脈試劑混勻靜置作為空白對照，在分光光度計可見光540 nm處測定吸光值[9-10]，根據(jù)制作好的標準曲線進行計算。

表2 文蛤水解液風(fēng)味描述表Table 2 Flavour description table of Meretrix lusoria hydrolysate

1.2.7 鮮味氨基酸含量的測定 精確吸取離心后上清液2.0 mL，加入質(zhì)量分數(shù)10%TCA水溶液，混勻靜置30 min后過濾，用日立835-50型高速氨基酸分析儀測定。

1.2.8 呈味核苷酸含量的測定 精確吸取離心后上清液 2.0 mL，12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，過0.45 μm濾膜，制備質(zhì)量濃度為100 g/L的標樣，用Diamonsil（鉆石一代）C18型分析色譜柱分離，在紫外波長260 nm下檢測。

1.2.9 TAV及EUC的測定

1）TAV（滋味活性值）：定義為樣品中呈味物質(zhì)的測定值與呈味物質(zhì)的味閾值之比。通常認為，當TAV大于1時，該種呈味物質(zhì)對于樣品的呈味有顯著影響。并且數(shù)值越大，貢獻越大。相反，當比值小于1時，說明該呈味物質(zhì)對呈味貢獻不大，呈味作用不顯著。但這種方法也存在一定的缺陷，因為其并沒有考慮食品中各物質(zhì)間的相互作用對食品滋味的影響，如協(xié)同效應(yīng)、抵消作用等。

2）EUC（味精當量）：表示的是呈味核苷酸與鮮味氨基酸混合物協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強度，相當于所產(chǎn)生的鮮味強度所需單一味精的量。它們之間的關(guān)系是最先由Yamaguchi和Yoshikawa等提出的[12]，并用下面的方程表示：

式（3）中：EUC 是味精當量（g/L）； ai為鮮味氨基酸（Asp 或 Glu）的質(zhì)量濃度（g/L）；bi為鮮味氨基酸相對于 MSG的相對鮮度系數(shù) （Glu為 1；Asp為0.077）；aj為呈味核苷酸（5’-AMP、5’-IMP、5’-GMP）的質(zhì)量濃度（g/L）；bj為呈味核苷酸相對于IMP的相對鮮度系數(shù)（5’-AMP 為 0.18、5’-IMP 為 1、5’-GMP為2.3）；1 218是協(xié)同作用常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶酶活的測定

不同蛋白酶的酶切作用具有專一性，對蛋白質(zhì)的水解效果存在差異，水解液的風(fēng)味也不相同，因此考慮采用多種蛋白酶進行復(fù)合水解。本實驗中所用6種蛋白酶的特性及測定的酶活如表3所示。

表3 不同蛋白酶的特性及酶活Table 3 Characteristic of different proteases and enzyme activity

2.2 最優(yōu)蛋白酶的篩選

以感官評分為指標，研究了復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶對文蛤肉水解的效果，篩選能夠水解文蛤肉生產(chǎn)蛤類特征風(fēng)味濃郁、腥味較弱水解液的最優(yōu)蛋白酶。

根據(jù)專業(yè)知識和相關(guān)專家經(jīng)驗，取感官評分的權(quán)重系數(shù)ω1為0.7，水解度的權(quán)重系數(shù)ω2為0.1，水解得率的權(quán)重系數(shù)ω3為0.2。結(jié)果如表4所示，復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的綜合評分均大于3.4，且水解液色澤適中，氣味和滋味優(yōu)良，具備明顯的蛤類特征風(fēng)味，可用于進一步的條件優(yōu)化。

酸性蛋白酶和堿性蛋白酶處理的文蛤肉水解液具有明顯的腥味，故不選用。

2.3 最優(yōu)加酶量的確定

分別考察復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的用量對文蛤肉水解效果的影響，水解液綜合評分的結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的加酶量為100～300 U/g時，水解液對感官評分、水解度和水解得率的綜合評分呈先上升后下降的趨勢。3種蛋白酶均在200 U/g的用量時水解液感官評分最高，因此在二段法復(fù)合酶解工藝中控制3種酶的總加酶量為200 U/g左右。

表4 不同蛋白酶對文蛤肉水解的感官評價表Table 4 Sensory evaluation of different protease hydrolysates of Meretrix lusoria L.meat

圖1 不同加酶量對文蛤肉水解液風(fēng)味的影響Fig.1 Effects of concentration of protease on the flavor of hydrolysate

2.4 二段法復(fù)合酶水解條件的正交試驗優(yōu)化

設(shè)置一段加酶總量為150 U/g，采用正交實驗考察了復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶用量比、一段酶解溫度、風(fēng)味蛋白酶用量、一段酶解和二段酶解時間比對文蛤肉二段法復(fù)合酶解液風(fēng)味的影響，各因素和水平的設(shè)計見表1，實驗結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，感官評分最高的實驗組是第5組，為5.3分，因素組合為A2B2C3D1，所得的水解液具有較濃厚的鮮味和蛤類特征香氣。極差分析結(jié)果表明，影響水解液綜合評分的主次因素為酶解時間比＞風(fēng)味蛋白酶加量＞復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶用量比＞一段酶解溫度，各因素的最佳組合為A2B2C3D3，為最優(yōu)酶解工藝條件。采用優(yōu)化后的二段法復(fù)合酶解工藝條件：復(fù)合蛋白酶75 U/g，中性蛋白酶75 U/g，在45℃、自然pH下水解3 h；然后加入風(fēng)味蛋白酶50 U/g，在50℃、自然pH下水解1 h，最終獲得的水解液的感官評分為5.5分，總氨基氮含量為4.16 g/L，水解度為35.3%，水解得率為36.4%，與楊晉論文[5]中用于海味香精的文蛤肉水解液的水解度相似。

表5 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Result and design test of orthogonal tests

2.5 最佳水解條件下水解液氨基酸、核苷酸含量和EUC的測定

勻漿后細胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)多種內(nèi)源酶釋放，并在熱處理階段，對細胞中的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子進行部分降解，其中核酸降解產(chǎn)物5’-AMP、5’-IMP、5’-GMP等具有較好的呈味作用。在此基礎(chǔ)上，實驗中還添加了3種蛋白酶，將文蛤蛋白質(zhì)進一步分解成多肽、寡肽和游離氨基酸。而蛋白質(zhì)的充分水解，也能夠促進呈味核苷酸在后續(xù)熱處理過程的釋放。

2.5.1 呈味氨基酸含量 最佳水解條件下游離氨基酸含量及TAV如表6所示。

表6 最佳水解條件下游離氨基酸含量及TAVTable 6 Content and TAV of free amino acids under the best hydrolysis conditions

結(jié)果顯示，游離氨基酸總質(zhì)量濃度為4.15 g/L，其中含量最高的分別是?；撬幔?.949 6 g/L）、丙氨酸（0.869 6 g/L）、脯氨酸（0.400 6 g/L），以及谷氨酸（0.368 4 g/L），而鮮味氨基酸和甜味氨基酸的含量分別占游離氨基酸總量的12.7%和27.6%，總質(zhì)量分數(shù)40.3%，相對于陳美花[14]的馬氏珠母貝MRPs中鮮味氨基酸含量，文蛤酶解液中鮮味氨基酸含量稍少一些，但其谷氨酸和丙氨酸的TAV高達12.3和14.5，可見谷氨酸和丙氨酸對文蛤水解液的鮮味和甜味有較大的貢獻作用。

2.5.2 呈味核苷酸含量 該水解條件下呈味核苷酸及TAV如表7所示。結(jié)果表明，文蛤肉經(jīng)水解后呈味核苷酸含量豐富，5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP的TAV值高達4.54、1.76、0.96，而文獻表明文蛤肌肉中 5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP 的 TAV 值分別為0、1.0、0[14]，水解之后各種呈味核苷酸含量有了極大的提高。從另一篇文獻得知，一種文蛤美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中 5’-AMP、5’-IMP 的 TAV 值分別為 1.73、0.032[15]，而本次最佳水解條件下水解液的呈味氨基酸總量是一種馬氏珠母貝美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的4倍多，說明本工藝的處理過程能夠充分使得呈味核苷酸釋放。

表7 最佳水解條件下呈味核苷酸及TAVTable 7 Content and TAV of flavor nucleotides under the best hydrolysis conditions

2.5.3 味精當量EUC 測得最佳條件下水解液多肽質(zhì)量濃度為21.8 g/L，比丁桂森論文[13]中二段酶水解文蛤肉得到水解液的多肽質(zhì)量濃度（13.624 g/L）高出60%。測得其味精當量EUC為53.25 g/L，比陳美花論文[15]中馬氏珠母貝美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（22.86 g/L）高出1.2倍?？梢姡鞠涛断憔孽r味非常強。

3 結(jié)語

以感官評分為優(yōu)化指標，從6種蛋白酶中篩選獲得了復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，用于文蛤肉的水解，并通過實驗優(yōu)化確定了二段法復(fù)合酶解工藝條件：復(fù)合蛋白酶75 U/g，中性蛋白酶75 U/g，在45℃、自然pH下水解3 h；然后加入風(fēng)味蛋白酶50 U/g，在50℃、自然pH下水解1 h。在最優(yōu)條件下獲得的水解液感官評分可得5.5分，味精當量EUC為53.25 g/L，總氨基氮含量為4.16 g/L，水解度為35.3%，酶解得率為36.4%，多肽含量為21.8 g/L。該文蛤肉水解液?；撬?、丙氨酸、脯氨酸和谷氨酸等游離氨基酸含量豐富。牛磺酸有保護視網(wǎng)膜、增強心肌和提高免疫力的功能，丙氨酸和谷氨酸等游離氨基酸則對文蛤水解液的鮮味和甜味有較大的貢獻。本研究成果為制備蛤類特征風(fēng)味突出、腥味較弱的咸味香精，奠定了進一步研制的基礎(chǔ)。

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