徐圓媛 ， 余 靜 ， 陳立立 ， 成向榮 ，2， 施用暉 ，2， 樂(lè)國(guó)偉 *，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出機(jī)體清除能力，造成抗氧化系統(tǒng)失衡[1-2]。高糖能引起細(xì)胞中ROS水平增加，造成持久氧化應(yīng)激，這與某些疾病如高血糖癥、糖尿病及其并發(fā)癥的成因和發(fā)展密切相關(guān)[3]。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的多酚化合物，許多研究表明其具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗炎等廣泛的生理藥理學(xué)特性[4]。 α-硫辛酸（α-lipoic acid，LA）是天然抗氧化劑中效果最強(qiáng)的一種，能清除過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等多種ROS[5]。較多研究結(jié)果表明，硫辛酸對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用[6-8]，本研究中用硫辛酸作為藥物對(duì)照組。已有研究結(jié)果表明，白藜蘆醇對(duì)氧化損傷的細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[9-11]，其對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)核因子E2-相關(guān)基因 2（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號(hào)通路、增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性相關(guān)[12]，但對(duì)于細(xì)胞不同氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，不同濃度白藜蘆醇的作用表現(xiàn)和機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究中利用不同時(shí)間高糖誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，探討了白藜蘆醇保護(hù)細(xì)胞模型抑制氧化損傷的作用表現(xiàn)和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌細(xì)胞HepG2，購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；小牛血清，杭州四季青生物材料工程研究所提供；葡萄糖（Glu）、噻唑藍(lán)（MTT）、 2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針，美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品；SOD、MDA、T-AOC、GSH-PX測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、Trizol試劑盒，上海生工生物工程公司產(chǎn)品；熒光定量PCR AccuPower 2X GreenstarqPCR Master Mix試劑，BIONEER公司產(chǎn)品；白藜蘆醇、硫辛酸，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。測(cè)定與分析用水均為滅菌超純水。

二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司制造；SpectraMax M5/M5e酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司制造；One-Drop OD 1000+分光光度計(jì)，上海采邑生物科技有限公司提供；7900HT Fast Real-Time PCR儀，美國(guó)ABI公司制造。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) HepG2細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的DMEM的培養(yǎng)基中于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)胰蛋白酶消化。按體積比1∶3傳代培養(yǎng)。細(xì)胞懸液以6×104個(gè)/mL的密度接于96孔板，每孔 100 μL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組。正常對(duì)照組：含5.5 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)基（Control）；損傷組：含33 mmol/L 高糖培養(yǎng)基（G）；高糖加 10 μmol/L 硫辛酸對(duì)照組 （LA）；高糖加不同濃度白藜蘆醇處理組0.1 μmol/L（R0.1）、1 μmol/L（R1）、10 μmol/L（R10）。作用細(xì)胞時(shí)間分別為24、48、72 h。

1.2.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率 96孔板中細(xì)胞分組處理，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT，及80 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，M5酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)492 nm處的吸光度。

1.2.4 DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)自由基ROS水平 按1∶1 000體積比無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。96孔板細(xì)胞培養(yǎng)終止，去除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DCFHDA。37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

1.2.5 氧化還原指標(biāo)的測(cè)定 以細(xì)胞裂解液為樣本，參照南京建成生物工程研究所提供的相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，以及SOD、TAOC、GSH-PX活性。蛋白質(zhì)含量用BCA蛋白質(zhì)試劑盒定量。

1.2.6 Real-time PCR方法測(cè)定細(xì)胞Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá) 取培養(yǎng)48 h的細(xì)胞模型，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，One-Drop OD 1000+型分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以ABI-7000型熒光定量PCR儀，參照Accu Power 2X Greenstarq PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒，以β-action為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)Ct值進(jìn)行相對(duì)定量，用溶解度曲線評(píng)估PCR產(chǎn)物特異性。目的基因及內(nèi)標(biāo)引物設(shè)計(jì)見(jiàn)下表1。

表1 基因的引物序列Table 1 Sequence of the primers

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞在誘導(dǎo)劑的作用下，自由基產(chǎn)生增多，但這種損傷在適宜抗氧化劑的作用下有可能被修復(fù)。添加機(jī)體常見(jiàn)誘導(dǎo)物體外模擬氧化應(yīng)激，建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，評(píng)價(jià)抗氧化劑在細(xì)胞模型的作用，能夠體現(xiàn)其在病理狀態(tài)下的作用機(jī)制，為揭示氧化應(yīng)激機(jī)制以及研究和篩選抗氧化藥物和功能食品奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。高糖是常見(jiàn)的、極易獲得并且性質(zhì)穩(wěn)定的誘導(dǎo)劑。高糖代謝時(shí)，大量葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，無(wú)法及時(shí)進(jìn)行糖酵解，激活6種代謝旁路，其途徑中間產(chǎn)物過(guò)多可導(dǎo)致活性氧簇生成，同時(shí)激活蛋白激酶 C （PKC）， 導(dǎo)致 O2-·、ONOO-等ROS的生成過(guò)量，并促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，誘發(fā)氧化應(yīng)激，造成對(duì)細(xì)胞的毒性[13-14]。

由表2可知，與正常對(duì)照組相比，48、72 h損傷組細(xì)胞存活率極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明高糖的緩和損傷作用在48 h以上才會(huì)出現(xiàn)。與損傷組相比，Res、LA組均能顯著提高模型細(xì)胞存活率（P＜0.05），對(duì)損傷有顯著的抑制作用，并且有一定的濃度依賴性，R10組作用72 h時(shí)無(wú)顯著影響。

表2 白藜蘆醇對(duì)高糖細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effects of resveratrol on cell viability of high glucose-induced cell

2.2 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞自由基水平的影響

2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯 （DCFH-DA），一種針對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)的特異性熒光探針，可以特異性地與ROS結(jié)合，從而直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS量的變化[15]。傳統(tǒng)計(jì)算細(xì)胞ROS水平的方法，通常沒(méi)有考慮細(xì)胞存活的狀態(tài)，只單純地進(jìn)行熒光值的計(jì)算。作者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在不同作用濃度下，存活率變化顯著，考慮活細(xì)胞才能在檢測(cè)ROS時(shí)發(fā)出熒光，因此在計(jì)算ROS水平時(shí)需要去除細(xì)胞存活率的影響，校正過(guò)的ROS水平才能更準(zhǔn)確地反映實(shí)驗(yàn)實(shí)際狀況。

由表3可知，與正常對(duì)照組相比，48、72 h高糖損傷組能極顯著升高ROS水平（P＜0.01），添加抗氧化劑組均能顯著降低損傷模型的ROS水平，并具有一定的濃度依賴性。72 h R10組較R0.1、R1組ROS水平有顯著上升的趨勢(shì)。提示在R10作用72 h時(shí)，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有損害的促氧化作用。

由實(shí)驗(yàn)2.1、2.2結(jié)果可知，高糖不同于常見(jiàn)的H2O2急性損傷，它在24 h內(nèi)沒(méi)有顯著效果，需要代謝48 h以上才會(huì)對(duì)細(xì)胞存活率和自由基產(chǎn)生極顯著影響，造成氧化損傷。添加不同濃度Res能提高損傷模型的存活率、降低自由基水平。

表3 白藜蘆醇對(duì)高糖細(xì)胞自由基的影響Table 3 Effects of resveratrol on ROS of high

2.3 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響

由表3可見(jiàn)，與正常組相比，不同時(shí)間損傷組的 SOD、GSH-PX、T-AOC 均顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。與各個(gè)時(shí)間損傷組相比，添加LA和不同濃度Res時(shí)，SOD、GSH-PX、T-AOC均顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.05），并且Res對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)存在劑量效應(yīng)關(guān)系。48 h組Res各濃度氧化還原狀態(tài)整體水平均優(yōu)于其他兩個(gè)時(shí)間組。R10組作用效果最好，且在相同濃度下，Res效果優(yōu)于LA。

從氧化還原指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，高糖能顯著破壞細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)，加入白藜蘆醇能顯著抑制高糖造成的氧化損傷，R10組甚至能使氧化還原狀態(tài)接近甚至優(yōu)于正常對(duì)照組，推測(cè)可能是白藜蘆醇清除了細(xì)胞內(nèi)較多的活性氧類(lèi)物質(zhì)后使SOD、GSH-PX含量相對(duì)性增多，總抗能力提高。24 h下未出現(xiàn)顯著慢性損傷，但細(xì)胞氧化還原狀態(tài)已開(kāi)始發(fā)生改變；48 h下顯著造成氧化應(yīng)激 （P＜0.05），Res各濃度組均能不同程度改善氧化還原水平，并且 R10 組改善效果極顯著（P＜0.01）；72 h 長(zhǎng)期作用時(shí)，改善氧化還原狀態(tài)的程度顯著性低于48 h各組，并且高濃度可能會(huì)發(fā)生對(duì)損傷細(xì)胞的促氧化作用。

表3 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響Table 3 Effects of resveratrol on the redox states of high glucose-induced cell

2.4 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)的影響

Nrf2是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)因子，其活化后可以調(diào)節(jié)一些重要的抗氧化酶類(lèi)的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到毒物或者氧化物質(zhì)作用時(shí)，Nrf2蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化解偶聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)其調(diào)控的靶基因表達(dá)血紅素加氧酶 1（HO-1）、醌氧化還原酶 1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化和II相解毒酶，從而對(duì)抗ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激，保護(hù)正常的細(xì)胞不受其破壞[12]。

選取2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果中作用效果最好的48 h模型R10組以及相應(yīng)的高糖損傷組、LA組，RT-PCR測(cè)定其N(xiāo)rf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平。由圖1、2可知，與正常對(duì)照組相比，損傷組顯著降低Nrf2、HO-1的表達(dá)水平 （P＜0.05）；與損傷組相比，LA和Res均能極顯著升高 Nrf2、HO-1的表達(dá)水平（P＜0.01），并且R10組的升高水平更為顯著。表明在高糖損傷的細(xì)胞模型中，白藜蘆醇可以通過(guò)活化Nrf2通路，上調(diào)其下游抗氧化酶mRNA的表達(dá)，從而改善細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)4 8h以上時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低、自由基水平顯著上升（P＜0.05），造成細(xì)胞氧化應(yīng)激。

24、48、72 h時(shí)，各濃度白藜蘆醇均能改善損傷細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，其中R10組作用48 h效果極顯著（P＜0.01）。在一定范圍內(nèi)，隨著氧化應(yīng)激的加劇，白藜蘆醇的需要量可能發(fā)生變化，短期作用時(shí)，大劑量可以有效緩解氧化應(yīng)激；長(zhǎng)期作用時(shí)，大劑量可能會(huì)出現(xiàn)促氧化等不良影響。在適宜的低劑量下，能長(zhǎng)期維持氧化還原平衡狀態(tài)。因而不同氧化還原狀態(tài)對(duì)抗氧化劑的需要量可能會(huì)有不同，但其機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

R10組作用48 h時(shí)，上調(diào)Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平，通過(guò)提高損傷模型抗氧化相關(guān)通路重要基因的表達(dá)來(lái)改善氧化還原狀態(tài)。

圖1 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響Fig.1 Effects of resveratrol on the expression of Nrf2 of high glucose-induced cell

圖2 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the expression of HO-1 of high glucose-induced cell

3 結(jié)語(yǔ)

探討了不同濃度白藜蘆醇對(duì)不同時(shí)間高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，通過(guò)對(duì)細(xì)胞存活率和自由基水平的影響，以及氧化還原狀態(tài)、抗氧化通路相關(guān)基因的測(cè)定，結(jié)果顯示，白藜蘆醇能顯著升高高糖誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的存活率，通過(guò)清除細(xì)胞自由基水平、改善細(xì)胞抗氧化能力、上調(diào)Nrf2-ARE通路中Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)，改善并維持了細(xì)胞良好的氧化還原狀態(tài)。

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