徐亞男， 李 琦， 肖 婧， 倪永清， 單春會(huì)， 史學(xué)偉

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

非釀酒酵母是一類自然存在于葡萄酒發(fā)酵過程中的微生物，其代謝物對(duì)酒的香氣、風(fēng)味等感官特征有很重要的影響[1]。釀酒酵母和非釀酒酵母都參與酒精發(fā)酵過程，其中非釀酒酵母的脂肪酶產(chǎn)量高于釀酒酵母[2]，通常都是在發(fā)酵初期存在。脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一[3]，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點(diǎn)和催化活力。脂肪酶可以降解來自葡萄和酵母菌自溶的脂質(zhì)，釋放脂肪酸來改善葡萄酒的品質(zhì)[4]。葡萄酒生產(chǎn)中常用的脂肪酶多是來源于細(xì)菌或者絲狀真菌，但是其通常是不確定的復(fù)雜的酶的混合物，對(duì)葡萄酒可能存在某些不利影響。脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶[5]，它可作用于甘油三酯的酯鍵，使甘油三酯降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸。目前國內(nèi)外對(duì)野生微生物脂肪酶的研究與開發(fā)較為活躍。脂肪酶可以應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個(gè)方面[6]，尤其在新疆葡萄酒的生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用，脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味，可以增進(jìn)葡萄酒的香氣成分，改善酒的品質(zhì)，因此對(duì)脂肪酶的特性的研究十分必要。

作者通過對(duì)非釀酒酵母中高產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、酶活測(cè)定，最終得到高產(chǎn)脂肪酶菌株Y13。此研究為提高果酒品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，并對(duì)豐富釀造果酒菌種資源及擴(kuò)大果酒市場(chǎng)占有率具有重要的推動(dòng)作用。因此研究非釀酒酵母菌在新疆葡萄自然發(fā)酵過程中產(chǎn)脂肪酶特性亦十分有必要。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種及試劑

實(shí)驗(yàn)室保藏的24株酵母菌株，其生長發(fā)育樹見圖1。

本試驗(yàn)所使用化學(xué)試劑均為色譜純及分析純，由天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YPD培養(yǎng)基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨2.0 g/dL，酵母浸粉1.0 g/dL；蒸餾水配制，自然pH值，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 初篩培養(yǎng)基1 蛋白胨1.0 g/dL，酵母粉0.5 g/dL，NaCl 0.5 g/dL，CaCl20.01 g/dL，Tween80 1.0 g/dL，瓊脂 1.5 g/dL；pH 7.2。

1.2.3 初篩培養(yǎng)基2 蛋白胨1.0 g/dL，葡萄糖0.5 g/dL，硝 酸 銨 0.1 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，NaCl 0.05 g/dL，K2HPO40.1 g/dL，瓊脂 2 g/dL，橄欖油乳化液1.2 g/dL，羅丹明B 0.1 g/dL。

1.2.4 種子培養(yǎng)液 葡萄糖10 g/dL，蛋白胨5 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，MgSO40.5 g/dL；pH 7.2。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10 g/dL，牛肉浸膏10 g/dL，K2HPO42.0 g/dL，MgSO40.3 g/dL，橄欖油乳化液10 g/dL；pH 7.5。 詳見文獻(xiàn)[7]。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株活化及擴(kuò)增培養(yǎng)

2.1.1 菌株活化 將 4℃保藏的釀酒酵母菌株，分別接種于YPD液體管培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)48 h活化。

2.1.2 擴(kuò)增培養(yǎng) 將活化的菌株按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接于已裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃、180 r/min搖床擴(kuò)增培養(yǎng)72 h。

2.2 菌株產(chǎn)酶鑒定

酵母菌接種于初篩培養(yǎng)基1平板上，37℃培養(yǎng)4 d。脂肪酶能分解Tween80在菌落周圍形成的白色透明圈。

酵母菌接種于初篩培養(yǎng)基2平板上，37℃培養(yǎng)4 d。產(chǎn)脂肪酶的菌株會(huì)出現(xiàn)橘黃色熒光圈，挑選熒光圈大的進(jìn)行復(fù)篩。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶學(xué)特性研究，利用酶學(xué)特性優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件。

2.4 脂肪酶粗酶液的提取及酶活測(cè)定

挑取菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中培養(yǎng)48 h。種子培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中培養(yǎng)。收集發(fā)酵液，4℃下10 000 r/min離心10 min，獲得上清液作為粗酶液。

在試驗(yàn)溫度和試驗(yàn)pH下，每分鐘釋放1 μmol脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位 （μmol/（min·mL）），以U表示 。用NaOH滴定法進(jìn)行酶活測(cè)定[8]。

2.5 脂肪酶酶學(xué)特性研究方法

分別選取測(cè)定溫度、pH、金屬離子、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響為單因子，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，計(jì)算公式如下：

式（1）中：V 為滴定樣液消耗的 NaOH 體積（mL），V0為滴定空白樣消耗的NaOH體積 （mL），t為反應(yīng)時(shí)間（min），n 為酶液體積（mL），M 為滴定用的 NaOH溶液的濃度（mol/mL）。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)脂肪酶菌株鑒定

經(jīng)試驗(yàn)，通過肉眼觀察和紫外燈照射觀察發(fā)現(xiàn)，Y9、Y13、Y19、Y21 透明圈和熒光圈比較明顯，可以判定 Y9、Y13、Y19、Y21這 4株菌株可以產(chǎn)生脂肪酶，結(jié)果見圖2。

圖2 Y9、Y13、Y19、Y21透明圈和熒光圈比較結(jié)果Fig.2 Compare the results transparent and fluorescent ring of Y9、Y13、Y19、Y21

透明圈直徑越大酶活越高[9]。由表1根據(jù)透明圈的直徑大小的比較可得，透明圈的直徑大小Y19＜Y21＜Y9＜Y13，因此 Y13 酶活最高。

表1 鑒定結(jié)果Table 1 Authentication

3.2 脂肪酶酶學(xué)特性

3.2.1 溫度對(duì)酶活的影響 將酶液分別在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃中保溫 30 min，在35℃下測(cè)定其酶活力（其他條件為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件）。結(jié)果見圖3。

由圖3可知，0～40℃脂肪酶的酶活一直在升高，脂肪酶保持較高的穩(wěn)定性，在40℃以上時(shí)，脂肪酶的酶活迅速下降，這是因?yàn)?0℃以上酶已變性失活。因此脂肪酶在40℃左右最為穩(wěn)定。

圖3 溫度對(duì)酶活的影響Fig.3 Influence of temperature on enzyme activity

3.2.2 pH對(duì)酶活的影響 在酶活液中分別加入pH為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的緩沖液，在35℃下測(cè)定酶活力（其他條件為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件）。結(jié)果見圖4。

圖4 pH對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of PH on enzyme activity

由圖4可知，在pH為5.0～7.5范圍內(nèi)，酶活力一直升高，pH超過7.5，酶活力下降。脂肪酶在pH 7.0～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性好，顯示較高活性，可見該脂肪酶為中性脂肪酶[10]。

3.2.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 將Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Na+、K+、Zn2+、Mg2+分別加入到酶液中， 在 35 ℃下測(cè)定酶活（其他條件為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件）。結(jié)果見圖5。

圖5 金屬離子對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of metal ion on enzyme activity

由圖5可知，不同的金屬離子對(duì)酶活的影響不同。Fe2+、Cu2+、Ca2+對(duì)酶有明顯的激活作用；Mn2+、Na+、K+、Zn2+對(duì)酶有微弱的激活作用；而Mg2+對(duì)酶具有一定的抑制作用。其中，Ca2+對(duì)酶的激活作用最顯著。

3.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響 將酶液分別培養(yǎng)24、36、48、60、72、84 h，35 ℃下測(cè)定酶活（其他條件為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件），結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of culture time on enzyme activity

由圖6可知，培養(yǎng)時(shí)間在36～60 h產(chǎn)酶能力隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，自60 h開始減少，產(chǎn)酶能力最大培養(yǎng)時(shí)間在60 h左右。

3.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)得出：產(chǎn)酶的最適溫度為40℃，最適 pH 為 7.0～7.5，F(xiàn)e2+、Cu2+、Ca2+對(duì)酶有明顯的激活作用，Ca2+作用最明顯，最適培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取影響力較大的4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

比較本實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)因素中Rj的大小，可以看出影響因素A＞C＞D＞B。優(yōu)化組合為A1B2C3D3。即高產(chǎn)脂肪酶菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度39℃，pH為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為65 h，添加適量Ca2+。

4 結(jié)語

通過產(chǎn)脂肪酶試驗(yàn)，根據(jù)透明圈和熒光圈的有無，以及透明圈直徑的大小，確定Y13是脂肪酶高產(chǎn)菌株。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化得酶的最適培養(yǎng)溫度為39℃，最適pH為7.0，Ca2+促進(jìn)酶的發(fā)酵，最適培養(yǎng)時(shí)間為65 h，溫度是產(chǎn)酶試驗(yàn)的最大影響因素。

脂肪酶可以應(yīng)用于食品工業(yè)的各個(gè)方面，例如用于有機(jī)相合成的具有轉(zhuǎn)酯化或酯化功能的脂肪酶的規(guī)?；a(chǎn)，對(duì)于酶催化合成精細(xì)化學(xué)品和手性化合物有重要意義。食品工業(yè)利用酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應(yīng)來生產(chǎn)各種香精酯，作調(diào)料劑；用有1，3-專一性的微生物脂肪酶提高食用油營養(yǎng)價(jià)值和增加食用油的花色品種[11]，制備代可可酯等高檔油脂；另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣，改善面包品質(zhì)，改善蛋白質(zhì)的發(fā)泡等方面。因此產(chǎn)脂肪酶菌株不僅可以應(yīng)用于葡萄酒的生產(chǎn)、改善酒的香氣成分、提高葡萄酒的品質(zhì)，而且還可以廣泛應(yīng)用于其他食品工業(yè)，增加食品風(fēng)味，提高食品的品質(zhì)。

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