高義霞， 周向軍， 袁毅君， 鮮鵬杰

（天水師范學院 生命科學與化學學院，甘肅 天水 741001）

硒是人體生命中必需的重要微量元素，具有增強機體免疫能力、抵抗自由基損傷、防病和調(diào)節(jié)甲狀腺機能等多種功能[1-3]。然而硒及其化合物對人體有效和中毒劑量范圍非常窄[4]，因此需通過有機硒化物或納米硒的形式來降低其毒性。納米硒生物吸收性高，能高效清除自由基[5-6]，且毒性比無機硒和天然有機硒低，活性比無機硒和天然有機硒高，從而克服了無機硒有效與中毒劑量十分接近而難以預(yù)防的缺點[7-9]，是一種有效的補硒藥物。納米硒的合成方法有抗壞血酸還原法、表面活性劑法、微乳液法、蛋白質(zhì)模板法、聚合物模板法、超聲化學法、溫度控制法和電化學法[10-11]等。抗壞血酸（VC）將亞硒酸（H2SeO3）中的 Se（IV）還原為 Se0后，此時硒不穩(wěn)定，極易團聚，如聚合體一旦超過納米尺度，其生物活性大大降低，因此需要對納米硒粒子表面進行修飾以防止聚集。刺槐豆多糖是刺槐種子胚乳部分焙炒后熱水抽提而成，常用于食品增稠劑、持水劑等，主要含有甘露糖和半乳糖[12]，但因相對分子質(zhì)量大、黏度高、溶解度低等限制了其臨床應(yīng)用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖、阿拉伯膠等多糖可作為模板用于合成納米硒[14]，且單質(zhì)硒微粒的形成和聚集易受到糖分子的調(diào)控[15]。因此在發(fā)生氧化還原反應(yīng)前加入刺槐豆多糖，其便吸附、包裹在初始形成的硒晶體表面，一方面阻止了粒子之間相互結(jié)合、團聚，使納米硒穩(wěn)定存在于溶液中，另一方面可減緩或控制粒子的生長，使產(chǎn)生的納米硒形成多種形貌。本研究中以刺槐豆多糖為軟模板制備納米硒，生成的納米硒具有良好的生物活性和廣泛用途，有效地提高了硒的生理功能。

1 實驗器材

1.1 材料及試劑

刺槐豆膠（食品級，分子質(zhì)量為300 ku，黏度3 700 mPa·s，主要含有甘露糖及半乳糖），甘肅弘諾科技貿(mào)易有限公司產(chǎn)品?？箟难幔琒igma公司產(chǎn)品。Savege液：氯仿與正丁醇以4∶1的體積比混合。亞硒酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

722型可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司制造；UV-2450型紫外光譜儀，日本島津公司制造；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠制造；D2F-6021型真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司制造；TGL-20M高速臺式冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司制造；JSM-6701F冷場發(fā)射型掃描電鏡，日本電子光學中心制造。

2 實驗方法

2.1 刺槐豆多糖的制備

參照高義霞方法[16]進行。

2.2 納米硒的制備

取一定量的亞硒酸、刺槐豆多糖溶液置于25 mL的比色管中，混合均勻后靜置片刻，加入一定量抗壞血酸溶液，加水稀釋至刻度，振搖混合均勻，將反應(yīng)混合液置于不同溫度水浴中或超聲波環(huán)境中一定時間，使H2SeO3中Se4+還原為Se0，并在刺槐豆多糖模板上生長至一定的形貌[17]。

2.3 表征手段

利用紫外光譜法表征刺槐豆多糖為軟模板的納米硒溶液的粒度變化；掃描電鏡（SEM）和X射線衍射（XRD）分別測定最佳制備納米硒工藝條件下反應(yīng)產(chǎn)物的形貌、粒度大小及形態(tài)。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫外光譜

圖1是不同溶液的全掃描吸收光譜，作為制備納米硒的反應(yīng)背景，可知VC最大吸收峰在265 nm處，刺槐豆多糖在此處無吸收峰。單純刺槐豆多糖、VC或兩者的混合液在大于400 nm的可見光區(qū)均無吸收，說明在該條件下無紅色納米硒生成。以刺槐豆多糖為介質(zhì)的總反應(yīng)體系中，在400～600 nm處有較強的吸收，峰值較寬，說明該條件下生成了大量的紅色納米硒，但溶液中含有未消耗的反應(yīng)物及中間產(chǎn)物，此結(jié)果與SEM表征結(jié)果 （見圖2）一致。

圖1 不同溶液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of different solutions

圖2 H2SeO3、刺槐豆多糖和VC混合物的SEM分析Fig.2 SEM analysis mixture of H2SeO3，locust bean polysaccharides and VC

據(jù)測定膠體溶液的雙波長法[18]，膠體粒徑參數(shù)

式（1）中， A1、 A2分別為波長 λ1、 λ2處的吸光值。

固定波長λ1、λ2，當吸光值比值A(chǔ)2/A1不變時膠體粒徑不變，生成的納米硒粒徑均勻，處于穩(wěn)定狀態(tài)。為避開VC的吸收且使測定方便，試驗選擇410nm和490 nm作為納米硒測定波長，并以A410/A490作為表征納米硒粒度隨時間變化的依據(jù)[19]。

3.2 反應(yīng)物濃度對納米硒的影響

固定 H2SeO3濃度為 0.1 mmol/L，VC濃度為0.1 mmol/L，改變刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)，40℃反應(yīng)4 h，考察其對納米硒的影響，結(jié)果見圖3（a）。隨刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)的增加，吸光值呈明顯增大趨勢，當刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)為0.1‰時，吸光值基本保持不變，但A410/A490開始降低；當刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)為0.2‰時，A410/A490維持在1.7左右，說明此時納米硒顆粒穩(wěn)定，故刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)選擇0.2‰。固定H2SeO3濃度為0.01 mmol/L，刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)為0.2‰，改變VC濃度，40℃反應(yīng)4 h，考察其對納米硒形成的影響，結(jié)果見圖3（b）。隨著VC濃度的增加，吸光值逐漸增大，當VC濃度為0.05 mmol/L時，吸光值最大且趨于平穩(wěn)，但此時A410/A490為1.68，且持續(xù)增加；當VC濃度為0.1 mmol/L，A410/A490穩(wěn)定在1.77，說明此時納米硒粒度均勻穩(wěn)定，因此選擇 VC 濃度為 0.05～0.1 mmol/L。 理論上按 n（VC）/n（H2SeO3）=2∶1 計量關(guān)系發(fā)生氧化還原反應(yīng)，但稍過量的VC能提供還原性介質(zhì)，使晶核生長速度加快，同時起穩(wěn)定納米硒的作用[20-21]。 n（VC）/n（H2SeO3）=5∶1～10∶1 為宜，本試驗則選擇 5∶1。

圖3 刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)及VC濃度對納米硒的影響Fig.3 Effects of locust bean polysaccharides and VC concentration on nano-selenium

3.3 不同溫度下反應(yīng)時間對納米硒的影響

固定H2SeO3濃度為0.01 mmol/L，刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)為0.2‰，VC濃度為0.05 mmol/L，考察20、40、60℃和80℃下不同時間對納米硒的影響，結(jié)果見圖4。 由圖 4（a）和（b）可知，隨反應(yīng)時間的延長，兩者反應(yīng)物吸光值不斷增加，2 h后均趨于穩(wěn)定，A410/A490分別維持在1.76和1.8左右，說明此時納米硒穩(wěn)定；和20℃相比，40℃生成物吸光值更高，說明該條件下反應(yīng)較為迅速充分。由圖4（c）可知，60℃條件下，反應(yīng)混合物吸光值隨時間的增加而明顯增大，5 h后吸光值增加程度減緩，但反應(yīng)4 h后，A410/A490下降明顯，說明此時納米硒穩(wěn)定程度開始降低。由圖4（d）可知，80℃條件下，吸光值隨時間的延長呈急劇增加趨勢，4 h后逐步趨于平穩(wěn)，但A410/A490一直明顯降低，說明該條件下形成的納米硒有增大、團聚趨勢[22]，不適合本試驗。試驗中發(fā)現(xiàn)，在較高溫度下，隨著時間的延長，溶液顏色加深，說明納米硒顆粒隨溫度升高有定向生長趨勢，形成了其它形貌[23-24]。綜合考慮40℃和60℃吸光值及A410/A490，從節(jié)省能源等因素綜合考慮，選擇40℃反應(yīng)4 h作為納米硒制備條件。

圖4 不同溫度下反應(yīng)時間對納米硒的影響Fig.4 Effects of reaction time on nano-selenium under different temperature

3.4 掃描電鏡表征

在上述篩選出的條件，即刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)為 0.2‰，n（VC）/n（H2SeO3）為 5∶1，40 ℃反應(yīng) 4 h，制備的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離心后在室溫條件下放置一個月仍為紅色，溶液中無沉淀，進行SEM分析，結(jié)果見圖5，可知此條件下制備的納米硒為球狀分子，粒徑約在95～100 nm，顆粒粒度大小均一、分散均勻。

3.5 X射線衍射分析

以質(zhì)量分數(shù)0.2‰刺槐豆多糖為分散體系，VC和 H2SeO2（兩者摩爾比 5∶1）40 ℃水浴反應(yīng) 4 h，制得納米硒刺槐豆多糖分散乳液，冷凍離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得納米硒溶液，-20℃冷凍干燥至恒質(zhì)量，取固體粉末進行X射線衍射分析，并與刺槐豆多糖衍射圖比較。

圖5 最佳條件下反應(yīng)產(chǎn)物的SEM分析Fig.5 SEM analysis of Reaction product under the optimal conditions

圖6為1和2兩個樣品在2°≤2θ≤85°范圍內(nèi)的XRD分析圖。

圖6 反應(yīng)產(chǎn)物和刺槐豆多糖的XRD分析Fig.6 XRD analysis of Reaction product and Locust bean polysaccharides

結(jié)果表明：樣品2有X衍射峰，說明刺槐豆多糖是雜多糖，如糖蛋白質(zhì)，因為均多糖不能形成晶體，為無定型粉末；由圖與樣品1的衍射峰對比可知，兩種物質(zhì)峰形及位置相同，說明樣品1中沒有結(jié)晶態(tài)物質(zhì)，即以刺槐豆多糖為模板生成的納米硒非晶態(tài)亦為無定型粉末。

4 結(jié)語

通過控制實驗條件，以刺槐豆多糖為模板，用抗壞血酸還原亞硒酸的方法制備納米硒。當抗壞血酸和亞硒酸摩爾比為5∶1，刺槐豆多糖質(zhì)量分數(shù)為0.2‰，40℃反應(yīng)4 h后可得紅色均勻的納米硒顆粒，其粒度大多在95～100 nm，分散相對均勻，X衍射顯示其為非晶態(tài)無定型粉末。納米硒具有硒和刺槐豆多糖的雙重功效，有望在營養(yǎng)和疾病防治方面獲得進一步應(yīng)用。

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