李艷梅， 趙福順

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014109）

大蒜（Allium sativum L）為百合科蔥屬多年生草本縮根植物，俗稱葫、獨(dú)蒜、葫蒜等，鱗莖俗稱“大蒜”[1-2]。大蒜的化學(xué)成分齊全，含有水、維生素、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)類、糖類、微量元素及含硫化合物等，含硫化合物為大蒜的主要活性物質(zhì)[3-7]。大蒜對(duì)真菌具有一定的抑制作用，其功能原理主要是含硫化合物成分與重要的巰基包含酶相互作用，使酶失去功用[8-12]。利用其抗菌原理，大蒜生物活性物質(zhì)在臨床上被廣泛的應(yīng)用。馬穆英等研究大蒜水溶液對(duì)幾十種常見(jiàn)真菌的抑制和殺菌作用，結(jié)果表明，根據(jù)測(cè)定的殺菌率，大蒜抗真菌的能力與化學(xué)防腐劑甲苯酸和山梨酸鉀的抗菌能力相當(dāng)[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜，購(gòu)于內(nèi)蒙古包頭市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；番茄晚疫病菌，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系提供；無(wú)水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，均購(gòu)于天津市化學(xué)試劑三廠，分析純；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB），購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海嘉鵬科技有限公司制造；KG-SX-700型滅菌鍋，日本島津公司制造；VD-1320型無(wú)菌操作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)電子公司制造；MJX-150BX霉菌培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將番茄晚疫病菌接種于滅菌后的PDA培養(yǎng)基上，26℃下培養(yǎng)72 h，活化3次，將第3代菌種采用血球板計(jì)數(shù)法，用滅菌后的生理鹽水稀釋成 1×107～1×109CFU/mL 的菌懸液。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)方法 采用牛津杯法[14]，配制PDA培養(yǎng)基，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固。將0.2 mL菌懸液接入培養(yǎng)基中，涂布均勻。將牛津杯放在培養(yǎng)基上，將0.2 mL待測(cè)液注入牛津杯中，以待測(cè)液的溶劑作為對(duì)照，平行3次，在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)量抑菌圈的大小，照相。

1.2.4 抑菌物質(zhì)提取工藝

1）提取溶劑的選擇：稱取各2.00 g大蒜粉末共10份，置于不同的三角瓶中，分別加入提取溶劑水、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、體積分?jǐn)?shù)90%乙醇、無(wú)水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇。料液比為 1∶5 （g/mL），在40℃提取2 h。然后按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳溶劑。

2）提取溫度的選擇：稱取各2.00 g大蒜粉末共6份，置于不同的三角瓶中，采用1）中選擇的最佳溶劑，料液比為 1∶5 （g/mL），提取時(shí)間為 2 h，提取2 次。 按 1.2.2 的提取工藝， 分別在 25、30、40、45、50、55℃下提取。然后按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳溫度。

3）提取時(shí)間的選擇：稱取各2.00 g大蒜粗粉共6份，置于不同的三角瓶中，采用已確定的最佳溶劑和最佳溫度，料液比為1∶5（g/mL）。按1.2.2的提取工藝， 分別在 1、2、3、4、5 h的條件下超聲波輔助提取2次，然后按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳提取時(shí)間。

4）料液比的選擇：稱取各2.00 g大蒜粗粉共6份，置于不同的三角瓶中，采用之前確定的最佳條件，按 1.2.2 的提取工藝，分別在 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 （g/mL）的條件下超聲波輔助提取2次。按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳料液比。

5）浸提次數(shù)的選擇：稱取各2.00 g大蒜粗粉共4份，置于不同的三角瓶中，采用已確定的提取條件，按 1.2.2的提取工藝，分別提取 1、2、3、4次。 按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳提取次數(shù)。

6）正交實(shí)驗(yàn)：影響提取效率的因素是提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、提取料液比（C）、浸提次數(shù)（D）。根據(jù)以上單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò) L16（44）正交實(shí)驗(yàn)，經(jīng)比較各自的抑菌效果，確定大蒜抑菌成分的最佳提取條件。

1.2.5 最小抑菌質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)和最小殺菌質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn) 采用二倍稀釋法，取具塞試管9支編號(hào)，分別加5 mL的PDB液體培養(yǎng)基。取0.8 g/mL的大蒜粗提液5 mL加到1號(hào)試管中混勻，從1號(hào)試管中取5 mL加到2號(hào)試管中，以此類推，加到8號(hào)試管為止，再將第8支試管棄去5 mL。即各試管中藥液 的 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2 mg/mL，以不加大蒜粗提液為空白對(duì)照，滅菌。將每支試管中加入0.2 mL菌懸液，26℃，150 r/min培養(yǎng)72 h。觀察試管是否渾濁，不渾濁記為“—”，渾濁記為“+”，以未渾濁的最小質(zhì)量濃度作為最小抑菌質(zhì)量濃度。從每支試管中取0.2 mL加到PDA培養(yǎng)基中，涂布均勻，培養(yǎng)72 h。無(wú)菌落生長(zhǎng)記為“—”，有菌落生長(zhǎng)記為“+”，以未長(zhǎng)菌的最小質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)選

根據(jù)1）的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了最佳提取溶劑的選擇實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，不同溶劑其提取效果表現(xiàn)差異很大。水、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，提取液的抑菌圈直徑均大于30 mm；體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、體積分?jǐn)?shù)90%乙醇、無(wú)水乙醇提取液的抑菌圈直徑在20～30 mm；三氯甲烷、正丁醇提取液的抑菌圈直徑在10～20 mm；石油醚提取液的抑菌圈直徑小于10 mm。根據(jù)其溶質(zhì)相似相溶的原理，其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)才能易于混溶，其中體積分?jǐn)?shù)30%乙醇提取液的抑菌圈直徑最大，因此選擇體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作為最適溶劑。

圖1 溶劑對(duì)大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.1 Effects of different solvents on antifungal substances

2.2 提取溫度的優(yōu)選

用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作為提取溶劑，根據(jù)2）的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了最佳提取溫度的選擇實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著溫度增高，其抑菌效果逐漸提高，以提取溫度在35℃時(shí)，提取物的抑菌效果最好。隨著提取溫度的不斷增高，抑菌效果降低，這可能是由于溫度過(guò)高，使大蒜中的抑菌活性成分被降解。所以選擇35℃作為最佳提取溫度。

2.3 提取時(shí)間的優(yōu)選

用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作為提取溶劑，提取溫度為35℃時(shí)，不同時(shí)間處理提取液的抑菌效果見(jiàn)圖3。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液的抑菌效果逐漸增高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2～3 h時(shí)，抑菌效果最好；當(dāng)提取時(shí)間4～5 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液的抑菌效果迅速下降。所以，選擇3 h作為最佳提取時(shí)間。

圖2 提取溫度對(duì)大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.2 Effects of different temperature on antifungal substances

圖3 提取時(shí)間對(duì)大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.3 Effects of different time on antifungal substances

2.4 提取料液比的優(yōu)選

用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作為提取溶劑，提取溫度為35℃，提取時(shí)間為3 h，不同的料液比的提取液抑菌效果見(jiàn)圖 4。當(dāng)料液比為 1∶5～1∶10 （g/mL）時(shí)，隨著提取溶劑的增加，提取液抑菌效果也逐漸增高；當(dāng)料液比在 1∶10～1∶30 （g/mL）時(shí)，抑菌效果隨料液比的變化趨于穩(wěn)定。提取溶劑的增加，使物料與溶劑的接觸面積增大，有效成分的浸出也隨之加快，抑菌活性增強(qiáng)[8]。所以，選擇 1∶10 （g/mL）作為最適宜的料液比。

2.5 提取次數(shù)

用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作為提取溶劑，提取溫度為 35 ℃，提取時(shí)間為 3 h，料液比 1∶10 （g/mL）。提取次數(shù)與提取液抑菌效果的關(guān)系見(jiàn)圖5。當(dāng)提取次數(shù)為1～2次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增多，抑菌效果也逐漸增高。當(dāng)提取次數(shù)為3～4次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，提取液的抑菌效果逐漸趨于平緩，所以選擇3次作為最適宜的提取次數(shù)。

圖4 提取料液比對(duì)大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.4 Effects of different solid-liquid ratio on antifungal substances

圖5 提取次數(shù)對(duì)大蒜粗提液抑菌效果的影響Fig.5 Effects of different times on antifungal substances

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

采用正交設(shè)計(jì)，確定了提取條件的最優(yōu)組合，結(jié)果見(jiàn)表1。各因素對(duì)番茄晚疫病菌抑菌效果影響的主次關(guān)系為 D＞A＞C＞B?？梢钥闯觯珹、B、C、D 4個(gè)因素的影響都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D因素影響顯著，A因素影響僅次于D，即因素D對(duì)番茄晚疫病菌的抑菌效果起決定性的作用；因素C和因素B對(duì)抑菌效果的影響不如A和D。因此，綜合考慮各因素對(duì)番茄晚疫病菌的影響結(jié)果，確定了最佳配方組合為A3B1C3D3，即提取溫度 40 ℃，料液比 1∶5 （g/mL），提取時(shí)間3 h，提取3次。

2.7 最小抑菌質(zhì)量濃度與最小殺菌質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行最小抑菌質(zhì)量濃度與最小殺菌質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)。由表2可以看出，當(dāng)藥液質(zhì)量濃度在15.7 mg/mL時(shí)5號(hào)試管未渾濁，當(dāng)藥液質(zhì)量濃度達(dá)到6.3 mg/mL時(shí)6號(hào)試管出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。然后進(jìn)行最小殺菌質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)，當(dāng)藥液質(zhì)量濃度在12.5 mg/mL時(shí)有少量菌落。則表明大蒜粗提液對(duì)番茄晚疫病菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為12.5 mg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度為25 mg/mL。

表1 L16（44）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of orthogonal test L16（44）

表2 大蒜粗提液的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of MIC and MFC of antifungal substance

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)大蒜抗番茄晚疫病菌有效成分提取條件的研究，結(jié)果表明：大蒜提取液以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作為提取溶劑，在40℃超聲波輔助提取3 h，提取次數(shù)為3次，料液比為1∶5（g/mL），即得到大蒜提取液的抑菌效果最佳的提取條件。在此條件下大蒜提取液對(duì)番茄晚疫病菌的抑菌直徑達(dá)到37.2 mm。大蒜提取液對(duì)番茄晚疫病菌最小抑菌質(zhì)量濃度為12.5 mg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度為25 mg/mL。由此可知，大蒜提取液的抑菌活性成分對(duì)番茄晚疫病菌有較強(qiáng)的抑制作用，科研成果為大蒜抑菌的深入研究與大蒜抑菌活性成分的開(kāi)發(fā)利用提供了良好基礎(chǔ)。

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