孟憲昉，吳子健，潘蕊

（1.天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，天津300134）

益生菌食品（probiotic food，PF）是益生菌進(jìn)入機(jī)體的有效載體，通常其有益活菌密度為106CFU/mL～107CFU/mL或g，才能確保發(fā)揮益生作用[1-4]，因此生產(chǎn)和銷售PF的整個過程應(yīng)優(yōu)先考慮如何保持食物中益生菌活菌濃度及其代謝能力[5-6]。益生菌冰淇淋（probiotic ice cream，PIC）是一類極具潛力的PF，其添加益生菌的方式有兩種：①將生產(chǎn)原料（不包括香精香料）混勻、滅菌后添加益生菌發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵（37℃～43℃），再經(jīng)老化、凝凍制成產(chǎn)品；②在老化階段，將發(fā)酵好的益生菌酸乳與其他物料進(jìn)行混合最后經(jīng)凝凍形成產(chǎn)品。冰淇淋的特點(diǎn)利于益生菌生長、生存以及貯存銷售期內(nèi)菌活力的維持，包括：①生產(chǎn)原料中的乳蛋白、乳糖等利于益生菌生長[7-8]；②冷凍貯藏溫度（-40℃～-20℃）利于保持活菌濃度與活力以及貨架期內(nèi)的存活；③終產(chǎn)品pH（5.5～6.5）既適應(yīng)消費(fèi)者對PF的口感需求，也利于活菌在銷售儲存過程的生存。但PIC中活菌濃度也受到諸多因素的影響，如：生產(chǎn)原料、益生菌酸乳發(fā)酵條件與程度、物料老化條件、凝凍過程以及產(chǎn)品貯存溫度等[9]，而保證經(jīng)老化后益生菌冰淇淋物料中益生菌濃度是目前亟待解決的問題。低聚果糖、低聚木糖以及菊粉等益生菌素可有效促進(jìn)有益菌的生長并維持其在各種食物載體中的活力[10]。嗜酸乳桿菌LA-5是丹麥科漢森公司Probio-TecR品牌下的益生菌菌株，具多種益生功能：消化（即同化作用）或者吸附富集膽固醇于細(xì)胞表面，降低機(jī)體血清膽固醇水平[11]；維持機(jī)體正常菌群平衡，預(yù)防腸道疾病[12-13]，且能迅速恢復(fù)抗生素干預(yù)治療引起的腸道菌群紊亂，預(yù)防[14]與治療[15]抗生素腹瀉；其抗氧化性能可延緩機(jī)體衰老[16]等等。本研究以嗜酸乳桿菌LA-5為益生菌株，分析制備PIC過程中酸乳后熟、冰淇淋物料老化以及低聚糖的添加對LA-5菌活濃度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

嗜酸乳桿菌LA-5直投式發(fā)酵劑：丹麥科漢森公司；脫脂乳粉：新西蘭恒天然公司；MR S培養(yǎng)基：北京博奧瑞興生物科技有限公司；考馬斯亮蘭G-250：sigma公司；菊粉、低聚果糖、低聚木糖和低聚異麥芽糖：山東保齡寶生物股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；冰淇淋配方如表1所示。

AUW120D型電子天平：日本島津公司；FE20型pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；LR H-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LDZX-40SCI立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、DHP-9162型電熱恒溫干燥箱：上海一恒科技有限公司；FA25型高速剪切分散乳化機(jī)：上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

表1 嗜酸乳桿菌LA-5酸乳冰淇淋配方Table 1 Lacbobacillus acidophilum（LA-5）ice cream formula

1.2 嗜酸乳桿菌LA-5加入冰淇淋物料的工藝過程

配制還原乳（脫脂乳粉∶蔗糖∶純凈水=11∶6∶83）→均質(zhì)→巴氏滅菌（85℃，0.25 h）→冷卻至38℃→添加LA-5直投式發(fā)酵劑（0.1 g發(fā)酵劑/L還原乳）→發(fā)酵（38℃，約13 h）→后熟（4℃，2 h～4 h）→加入其它處理后的冰淇淋原料（配方如表1所示）→攪拌混勻并均質(zhì)→老化（2℃～4℃，0 h～4 h）。

1.3 嗜酸乳桿菌活菌數(shù)檢測

嗜酸乳桿菌活菌數(shù)檢方法參照Souza C H B等的方法[17]，略有改變。用45.0 mL蛋白胨水（濃度為1 g蛋白胨/ 1000 mL）將5.0 g待測樣品稀釋分散均勻，并用蛋白胨水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)。同時將MR S培養(yǎng)基（含有麥芽糖）pH調(diào)節(jié)至6.0作為計數(shù)培養(yǎng)基，取1.0 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的樣品，采用傾注平板法檢測LA-5活菌數(shù)。

1.4 發(fā)酵乳后熟期間LA-5活菌數(shù)的變化

按方法1.2將酸乳發(fā)酵至凝乳后置于4℃下后熟（時間分別為 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h），取樣按方法1.3測定LA-5活菌數(shù)。

1.5 冰淇淋物料老化過程中LA-5存活率的變化

將后熟后的酸乳與冰淇淋其它成份（使用前進(jìn)行巴氏滅菌）按表1所示物料比混合均勻并經(jīng)均質(zhì)，然后置于2℃～4℃下進(jìn)行料液老化，時間分別采用1、2、3、4 h，然后取樣按方法1.3測定LA-5活菌數(shù)。

1.6 不同種類的低聚糖對LA-5存活率影響

不同種類的低聚糖（低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖和菊粉）分別按照20.0 g/L和40.0 g/L的添加量溶于發(fā)酵乳原料液中，然后按照方法1.2工藝進(jìn)行酸乳的發(fā)酵、冰淇淋料液的配置以及老化工藝，老化時間為2 h，取樣按方法1.3測定LA-5活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵乳后熟期間LA-5活菌數(shù)的變化

通常發(fā)酵乳后熟過程中益生菌在酸乳中的濃度會有一定變化，一般會先上升然后再下降，以LA-5濃度最大時確定最佳發(fā)酵酸乳后熟時間，以此確保有足夠活菌濃度的發(fā)酵酸乳能按照方法1.2配制LA-5益生菌冰淇淋老化前的物料。按照方法1.4檢測發(fā)酵乳后熟期間LA-5活菌數(shù)的變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 后熟期間嗜酸乳桿菌LA-5活菌濃度的變化趨勢Fig.1 Variation in the counts of Lactobacillus Acidophilus LA-5 during post-ripening time

酸乳發(fā)酵終點(diǎn)時，酸乳中的活菌濃度約為1.18×108cfu/g，經(jīng)過后酵0 h～9 h，在0 h～5 h期間，活菌濃度不斷增多到5 h時到達(dá)1.82×108cfu/g，然后在5 h～9 h期間，活菌濃度逐漸降低，到9 h時，活菌濃度0.975×108cfu/g。因此后酵最佳時間為5 h。

2.2 冰淇淋物料老化過程中LA-5存活率的變化

按照表1酸乳冰淇淋配方配制LA-5益生菌冰淇淋物料，其中LA-5酸乳比例為60%，經(jīng)攪拌混勻并均質(zhì)后進(jìn)行老化按照方法1.3測定了0、1、2、3℃和4℃下老化6 h后LA-5存活率，如圖2、圖3所示。

圖2 老化溫度對嗜酸乳桿菌LA-5存活率的影響Fig.2 Effect of aging temperature on the viable rate of LA-5

圖3 冰淇淋物料老化時間對嗜酸乳桿菌LA-5活菌濃度的影響Fig.3 Effects on variation in the counts of Lactobacillus Acidophilus LA-5

老化溫度對LA-5存活率的變化影響不大，存活率的變化范圍約在45%～49%，實(shí)際生產(chǎn)的老化溫度一般控制在0℃～4℃范圍內(nèi)變動。物料的老化時間對于活菌的存活率也有一定的影響：2℃下、老化時間在0 h～4 h內(nèi)，LA-5活菌數(shù)在1.05 cfu/g～0.61×108cfu/g范圍內(nèi)變化，其中0 h～2 h內(nèi)降低很快，2 h時的活菌數(shù)不到0 h時的60%；而2 h～4 h內(nèi)幾乎沒有變化?？赡艿脑蛟谟诶匣^程0 h～2 h，LA-5益生菌與老化的黃油等其它物料（特別是蔗糖）之間需要一定的適應(yīng)，微生物的細(xì)胞需要逐漸適應(yīng)這些物質(zhì)帶來的生理環(huán)境變化（如：滲透壓），這期間會有些微生物的細(xì)胞遭到淘汰。

2.3 低聚糖對嗜酸乳桿菌LA-5活菌數(shù)的影響

菊粉、低聚果糖、低聚木糖和低聚異麥芽糖這4種低聚糖對嗜酸乳桿菌LA-5均具有增殖作用，發(fā)酵乳按照表1所列的配方配制后，混勻并經(jīng)過均質(zhì)，取樣測定其LA-5活菌數(shù)，結(jié)果見圖4。

圖4 低聚糖對嗜酸乳桿菌LA-5活菌濃度的影響Fig.4 Effects of oligosaccharides on the counts of Lactobacillus Acidophilus LA-5

發(fā)現(xiàn)這4種低聚糖20 g/L和40 g/L添加量都能夠有效促進(jìn)LA-5的活菌數(shù)，其中添加20 g/L和40 g/L低聚果糖LA-5分別較空白對照組增加了約64%和129%，效果最好，且40 g/L添加量的效果明顯高于20 g/L添加量。但是經(jīng)過了2 h的物料老化后，冰淇淋料中的活菌數(shù)都會有明顯的降低，且除了低聚異麥芽糖，其它經(jīng)老化過程后物料的同種寡聚糖添加量為20 g/L和40 g/L之間的LA-5活菌數(shù)并沒有明顯的差異，其中還是含有低聚果糖的物料中含有的活菌濃度最高，20 g/L和40 g/L添加量下分別為1.253×108cfu/g和1.284×108cfu/g，分別比對照組大104%和109%，幾乎沒有什么差別。因此考慮到成本以及最終的效果，低聚果糖添加量在20 g/L時，老化后的冰淇淋物料中LA-5的活菌數(shù)較高。

3 結(jié)論

本研究表明添加低聚糖以及控制酸乳的后熟時間可以提高嗜酸乳桿菌LA-5益生菌冰淇淋老化后物料中LA-5活菌濃度；在4種被研究的低聚糖中，低聚果糖效果最好，添加量為20 g/L效果較佳；酸乳的后熟時間應(yīng)該控制在5 h。

[1] Sanders M E.Probiotics：considerations for human health[J].Nutrition Reviews,2003,61(3)：91-99

[2]Gibson G R,Probert H M,Van Loo J,et al.Dietary modulation of the human colonic microbiota：updating the concept of prebiotics[J].Nutr Res Rev,2004,17(2)：259-275

[3] Mattila-Sandholm T,Myll?rinen P,Crittenden R,et al.Technological challenges for future probiotic foods[J].International Dairy Journal,2002,12(2)：173-182

[4] Alamprese C,Foschino R,Rossi M,et al.Effects of Lactobacillus rhamnosus GG addition in ice cream[J].International journal of dairy technology,2005,58(4)：200-206

[5] Sanz Y.Ecological and functional implications of the acid-adaptation ability of Bifidobacterium：A way of selecting improved probiotic strains[J].International Dairy Journal,2007,17(11)：1284-1289

[6]Talwalkar A,Miller C W,Kailasapathy K,et al.Effect of packaging materials and dissolved oxygen on the survival of probiotic bacteria in yoghurt[J].International journal of food science&technology,2004,39(6)：605-611

[7]Clarke C.The science of ice cream-2nd Edition[M].UK：Royal Society of Chemistry,2012：41-68

[8] https：//www.uoguelph.ca/foodscience/sites/uoguelph.ca.foodscience/files/FindingScienceInIceCream.pdf

[9] Cruz A G,Antunes A E C,Sousa A L O P,et al.Ice-cream as a probiotic food carrier[J].Food Research International,2009,42(9)：1233-1239

[10]張樹海,吳子健,關(guān)利釗,等.益生菌素對嗜酸乳桿菌LA-5生長的影響[J].食品研究與開發(fā),2013(3)：88-90

[11]Lin M Y, Chen T W. Reduction of cholesterol by Lactobacillus acidophilus in culture broth[J]. Journal of Food and Drug Analysis, 2000,8(2)： 97-102

[12]Medellin-Pe?a M J,Griffiths M W.Effect of molecules secreted by Lactobacillus acidophilus strain La-5 on Escherichia coli O157：H7 colonization[J].Applied and environmental microbiology,2009,75(4)：1165-1172

[13]Savard P,Lamarche B,Paradis M E,et al.Impact of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 and,Lactobacillus acidophilus LA-5-containing yoghurt,on fecal bacterial counts of healthy adults[J].International journal of food microbiology,2011,149(1)：50-57

[14]Wenus C, Goll R, Loken E B, et al. Prevention of antibiotic-associated diarrhoea by a fermented probiotic milk drink [J]. European journal of clinical nutrition, 2007, 62(2)： 299-301

[15]Jürgen Schrezenmeir M D.Probiotic lactobacilli and bifidobacteria in a fermented milk product with added fruit preparation reduce antibiotic associated diarrhea and Helicobacter pylori activity[J].Journal of Dairy Research,2011,78：396-403

[16]Rajpal S,Kansal V K.Probiotic Dahi containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum stimulates antioxidant enzyme pathways in rats[J].Milchwissenschaft,2009,64(3)：287-290

[17]Souza C H B, Saad S M I. Viability of Lactobacillus acidophilus La- 5 added solely or in co-culture with a yoghurt starter culture and implications on physico-chemical and related properties of Minas fresh cheese during storage[J]. LWT-Food Science and Technology,2009, 42(2)： 633-640