段慶梓，尚柯，張玉，張良

（成都市食品藥品檢測(cè)中心，四川成都610045）

目前，針對(duì)肉制品源性鑒定方法主要有蛋白質(zhì)鑒定（等電聚焦電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、色譜等）和基因鑒定兩類。但食品中的肉類在經(jīng)過(guò)蒸煮、熏烤等加工烹調(diào)過(guò)程后，失去了原有的蛋白質(zhì)特性，因此蛋白質(zhì)對(duì)肉類的鑒定存在一定的局限性。而利用PCR進(jìn)行基因鑒定則很大程度上彌補(bǔ)了這一不足，DNA的耐熱性強(qiáng)，在高溫處理過(guò)的食品中仍能提取出小片段的DNA，并且DNA鑒別不依賴于組織和細(xì)胞的類型[1-3]。

近些年來(lái)，通過(guò)PCR方法對(duì)肉質(zhì)源性的鑒定已經(jīng)有了一定的研究。Dalmasso等選擇12S rDNA和16S rDNA兩個(gè)基因，建立了反芻動(dòng)物、禽類、魚類和豬肉的特異性引物，分別擴(kuò)增出不同大小的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)混合樣品中物種的鑒定[4]。陳文炳等開(kāi)發(fā)了真核生物所共有的18 S核糖體DNA（18S rDNA）與食品中豬、牛、羊、雞等多種動(dòng)物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測(cè)方法[5]。Tanabe等構(gòu)建了一對(duì)豬特異性引物，用于特異性擴(kuò)增豬Cytb中基因長(zhǎng)度為130bp的序列[6]；Fujimura等構(gòu)建了一對(duì)雞特異性引物，能特異性擴(kuò)增16S rDNA上一段102 bp的片段，在其他禽類中都沒(méi)有擴(kuò)增出該產(chǎn)物[7]。

本文通過(guò)對(duì)雞、鴨的Cyt-b基因進(jìn)行序列比對(duì)，設(shè)計(jì)了一條共同的上游引物（CD-U1）和雞、鴨各自的下游引物（C-L1，D-L1），并通過(guò)調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)中3條引物的比例，同時(shí)以豬肉作為負(fù)對(duì)照，擴(kuò)增得到的雞、鴨片段大小分別為505 bp和436 bp，而豬肉無(wú)任何條帶的擴(kuò)增，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物具有較好的特異性。同時(shí)，將PCR的結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，并分別與GenBank中雞、鴨的Cyt-b基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示我們所擴(kuò)增的即為雞、鴨Cyt-b基因的片段。且該多重PCR方法可檢測(cè)出混合樣品中雞、鴨肉的比例最低為10%。因此，該多重PCR方法可根據(jù)所得基因片段的大小差異來(lái)對(duì)禽肉中雞肉和鴨肉的成分進(jìn)行鑒定。

1 材料

1.1 樣品的采集

雞肉、鴨肉、豬肉均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻泻娃r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 主要試劑

動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自Generay公司）、DNA聚合酶、10×緩沖液（含Mg2+離子）（購(gòu)自TransGen公司）、DL1000 Marker和6×Loading Buffer（購(gòu)自寶生物工程公司）、dNTP和GoldView染料（購(gòu)自SolarBio公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[8-11]并參照GenBank中已提交的雞（GU261716.1）、鴨（EU755252.1）的序列，設(shè)計(jì)了雞、鴨共同的一條上游引物（CD-U1）和其各自的特異性下游引物（C-L1，D-L1）。CD-U1與C-L1擴(kuò)增雞的片段大小為505 bp，CD-U1與D-L1所擴(kuò)增鴨的片段大小為436 bp。引物序列見(jiàn)表1。

表1 雞、鴨多重PCR引物序列Table 1 Primer sequence of chicken and duck for multiplex PCR

2 方法

2.1 基因組DNA提取

依照Generay公司動(dòng)物組織基因組提取試劑盒操作說(shuō)明分別提取雞肉、鴨肉和豬肉的基因組DNA，所取組織量均為20 mg。提取的DNA用20 μL滅菌的超純水溶解，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多重PCR反應(yīng)體系的確定

經(jīng)引物比例調(diào)節(jié)后的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 雞、鴨肉質(zhì)鑒定的多重PCR反應(yīng)體系Table 2 Multiplex PCR system for detecting chicken and duck

配制完畢后充分混勻進(jìn)行如下PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性 2 min，30 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94℃30s，54℃30s，72℃30 s），72℃最后延伸10 min。反應(yīng)完畢后，將PCR產(chǎn)物取出，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

3 結(jié)果

3.1 多重PCR引物比例的確定

分別以不同體系的混合雞、鴨DNA為模板（表3），來(lái)調(diào)整三個(gè)引物之間的比例，按2.2方法進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而確定多重PCR反應(yīng)的最佳引物比例。

表3 雞、鴨多重PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)０灞壤齌able 3 Template proportion of chicken and duck for preliminary PCR μL

1）當(dāng)引物比例 CD-U1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.15∶0.15時(shí)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1（a）。

2）當(dāng)引物比例 CD-U1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.1∶0.25時(shí)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1（b）。

圖1 不同引物比例的PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)Fig.1 Different primer proportion of preliminary PCR

由圖1可以顯示，當(dāng)引物比例CD-U1∶C-L1∶DL1=0.25∶0.15∶0.15時(shí)，不論模板量的多少，雞條帶（505 bp）亮度總高于鴨條帶（436 bp），不符合預(yù)期結(jié)果；而當(dāng)引物比例 CD-U1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.1∶0.25時(shí)，雞、鴨條帶的亮度隨不同體系中模板量的變化而變化，且在雞、鴨模板量相同的條件下，所擴(kuò)增條帶亮度一致，符合預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果。因此選取引物比例CDU1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.1∶0.25為多重 PCR的引物比例。

3.2 雞、鴨肉成分的鑒定

將所提取的雞、鴨肉和豬肉基因組DNA分別按2.2方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 雞、鴨肉鑒定的PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of detecting chicken and duck

陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均成立，即雞肉擴(kuò)增出505 bp的條帶，鴨肉擴(kuò)增出436 bp的條帶，而豬肉和空白對(duì)照中均無(wú)條帶。

3.3 雞、鴨肉混合樣品的檢測(cè)

雞、鴨混合（即PCR模板中雞肉與鴨肉DNA的比例）依次為（0 ∶1）；（0.1 ∶0.9）；（0.25 ∶0.75）；（0.5 ∶0.5）；（0.75 ∶0.25）；（0.9 ∶0.1）；（1 ∶0）。模板混合均勻后，按2.2方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

圖3 多重PCR檢測(cè)雞鴨肉不同比例的混合模板Fig.3 Multiplex PCR detection of Mixture template containing chicken and duck.

第1泳道（模板完全為鴨肉）為鴨肉436 bp的條帶；第7泳道（模板完全為雞肉）為雞肉505 bp的條帶。第4泳道（雞、鴨模板比例為0.5∶0.5）則同時(shí)出現(xiàn)雞肉和鴨肉的條帶，且亮度一致，表明所選取的引物比例合適。整個(gè)PCR結(jié)果隨混合模板中雞、鴨DNA量的變化而相應(yīng)的改變。因此，該多重PCR體系可檢測(cè)出混合樣品中雞、鴨肉的比例最低為10%。

3.4 成都市雞、鴨肉的鑒別檢測(cè)

分別在成都市的生產(chǎn)、流通和餐飲環(huán)節(jié)隨機(jī)抽取雞、鴨肉各30批，用所建立的多重PCR方法進(jìn)行鑒別，部分（10個(gè)批次）檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 雞、鴨肉鑒別檢測(cè)的部分（10批）PCR結(jié)果Fig.4 Partial PCR results of detecting chicken and duck

PCR結(jié)果顯示目前成都市市場(chǎng)上的雞、鴨肉風(fēng)險(xiǎn)度較低，暫無(wú)摻偽造假現(xiàn)象。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)所選取的雞、鴨特異性引物均位于線粒體Cyt-b上，因?yàn)榫€粒體在動(dòng)物的各個(gè)組織均大量存在，并且Cyt-b基因具有很高的保守性[12]。通過(guò)比對(duì)雞、鴨的Cyt-b基因序列，確定了針對(duì)雞、鴨的特異性檢測(cè)引物，并進(jìn)行了相應(yīng)引物比例的PCR反應(yīng)。同時(shí)，還對(duì)雞、鴨混合模板進(jìn)行了PCR試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法所建立的多重PCR體系可檢測(cè)出混合樣品中雞、鴨肉的比例最低為10%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性性，將PCR產(chǎn)物送由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中雞、鴨的Cyt-b基因進(jìn)行比對(duì)（圖5）。比對(duì)結(jié)果顯示，我們所擴(kuò)增的雞（505 bp）片段和鴨（436 bp）片段確實(shí)位于Cyt-b基因上，表明試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。同時(shí)，用該方法對(duì)成都市場(chǎng)上的雞、鴨肉抽樣檢測(cè)顯示，目前市場(chǎng)上暫無(wú)雞、鴨肉的摻偽造假現(xiàn)象。

圖5 雞、鴨PCR測(cè)序結(jié)果分別與GenBank中Cyt-b基因的序列比對(duì)Fig.5 The sequence of PCR results for chicken and duck were compared with Cyt-b gene in Genbank,respectively

由于目前相關(guān)法律法規(guī)沒(méi)有明確規(guī)定，要求市場(chǎng)上的肉類制品標(biāo)示出所含肉類的種類及含量，所以市售的肉制品均只標(biāo)明成分而不標(biāo)明各成分含量。在這種情況下，對(duì)肉制品中不同種屬的肉類進(jìn)行定量檢測(cè)意義不大，故本試驗(yàn)中所使用的引物其特異性和靈敏度完全符合市場(chǎng)檢測(cè)的要求[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，建立的PCR檢測(cè)方法樣品用量少，結(jié)果準(zhǔn)確，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

[1] 李文靜,李燕俊.分子學(xué)方法鑒定肉制品種屬來(lái)源的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2009(3)：151-158

[2] 韓敏義,唐明麗.PCR在肉類科學(xué)中的應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(9)：57-60

[3] 劉旭輝,馬貴平,史喜菊,等.商品中動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(10)：91-94

[4] Dalmasso A,Fontanella E,Piatti P,et al.A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs[J].Mol Cell Probes,2004,18(2)：81-87

[5] 陳文炳,邵碧英,廖憲彪,等.加工食品中若干動(dòng)物成分的PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2005,26(8)：338-342

[6]TANABE S,MIYAUCHI E,MUNESHIG A E,et al.Method of detecting pork in foods for verifying allergen labeling and for identifying hidden pork in gradients in processed foods[J].Biotechnol Biochem,2007,71(7)：1663-1667

[7]FUJIMURA T,TANABE S,MORIMATSU F,et al.Specific discrimination of chicken DNA from other poultry DNA in processed foods using the polymerase chain reaction[J].Biotechnol Biochem,2008,72(3)：909-913

[8] Masunaga T,Chikuni K,Tanabe R,et al．A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay[J]．Meat Science,1999,51(2)：143-148

[9] 宗卉,范萬(wàn)紅,溫燕輝.應(yīng)用多重PCR同時(shí)檢測(cè)牛、羊源性成分[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2006,26(6)：21-22

[10]孫艷華,張智禹,牛晉陽(yáng),等.PCR法快速檢測(cè)熟肉制品中肉類來(lái)源[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2010,31(5)：139-142

[11]O irfan iLHAK,Ali ARSLAN.Identification of meat species by polymerase chain reaction technique[J].Turk J Anim Sci,2007,31(3)：159-163

[12]Unseld M,Beyermann B,Brandt P,et al.Identification of the species origin of highly processed meat products by mitochondrial DNA sequences[J].Genome Research,1995,4：241-243