段慶梓，尚柯，張玉，張良

（成都市食品藥品檢測中心，四川成都610045）

目前，針對肉制品源性鑒定方法主要有蛋白質(zhì)鑒定（等電聚焦電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗、色譜等）和基因鑒定兩類。但食品中的肉類在經(jīng)過蒸煮、熏烤等加工烹調(diào)過程后，失去了原有的蛋白質(zhì)特性，因此蛋白質(zhì)對肉類的鑒定存在一定的局限性。而利用PCR進行基因鑒定則很大程度上彌補了這一不足，DNA的耐熱性強，在高溫處理過的食品中仍能提取出小片段的DNA，并且DNA鑒別不依賴于組織和細胞的類型[1-3]。

近些年來，通過PCR方法對肉質(zhì)源性的鑒定已經(jīng)有了一定的研究。Dalmasso等選擇12S rDNA和16S rDNA兩個基因，建立了反芻動物、禽類、魚類和豬肉的特異性引物，分別擴增出不同大小的片段來實現(xiàn)混合樣品中物種的鑒定[4]。陳文炳等開發(fā)了真核生物所共有的18 S核糖體DNA（18S rDNA）與食品中豬、牛、羊、雞等多種動物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測方法[5]。Tanabe等構(gòu)建了一對豬特異性引物，用于特異性擴增豬Cytb中基因長度為130bp的序列[6]；Fujimura等構(gòu)建了一對雞特異性引物，能特異性擴增16S rDNA上一段102 bp的片段，在其他禽類中都沒有擴增出該產(chǎn)物[7]。

本文通過對雞、鴨的Cyt-b基因進行序列比對，設(shè)計了一條共同的上游引物（CD-U1）和雞、鴨各自的下游引物（C-L1，D-L1），并通過調(diào)節(jié)PCR反應中3條引物的比例，同時以豬肉作為負對照，擴增得到的雞、鴨片段大小分別為505 bp和436 bp，而豬肉無任何條帶的擴增，說明所設(shè)計的引物具有較好的特異性。同時，將PCR的結(jié)果進行測序，并分別與GenBank中雞、鴨的Cyt-b基因序列進行比對，結(jié)果顯示我們所擴增的即為雞、鴨Cyt-b基因的片段。且該多重PCR方法可檢測出混合樣品中雞、鴨肉的比例最低為10%。因此，該多重PCR方法可根據(jù)所得基因片段的大小差異來對禽肉中雞肉和鴨肉的成分進行鑒定。

1 材料

1.1 樣品的采集

雞肉、鴨肉、豬肉均購自當?shù)爻泻娃r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 主要試劑

動物基因組DNA提取試劑盒（購自Generay公司）、DNA聚合酶、10×緩沖液（含Mg2+離子）（購自TransGen公司）、DL1000 Marker和6×Loading Buffer（購自寶生物工程公司）、dNTP和GoldView染料（購自SolarBio公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計

通過查閱文獻[8-11]并參照GenBank中已提交的雞（GU261716.1）、鴨（EU755252.1）的序列，設(shè)計了雞、鴨共同的一條上游引物（CD-U1）和其各自的特異性下游引物（C-L1，D-L1）。CD-U1與C-L1擴增雞的片段大小為505 bp，CD-U1與D-L1所擴增鴨的片段大小為436 bp。引物序列見表1。

表1 雞、鴨多重PCR引物序列Table 1 Primer sequence of chicken and duck for multiplex PCR

2 方法

2.1 基因組DNA提取

依照Generay公司動物組織基因組提取試劑盒操作說明分別提取雞肉、鴨肉和豬肉的基因組DNA，所取組織量均為20 mg。提取的DNA用20 μL滅菌的超純水溶解，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多重PCR反應體系的確定

經(jīng)引物比例調(diào)節(jié)后的PCR反應體系見表2。

表2 雞、鴨肉質(zhì)鑒定的多重PCR反應體系Table 2 Multiplex PCR system for detecting chicken and duck

配制完畢后充分混勻進行如下PCR反應：94℃預變性 2 min，30 個擴增循環(huán)（94℃30s，54℃30s，72℃30 s），72℃最后延伸10 min。反應完畢后，將PCR產(chǎn)物取出，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

3 結(jié)果

3.1 多重PCR引物比例的確定

分別以不同體系的混合雞、鴨DNA為模板（表3），來調(diào)整三個引物之間的比例，按2.2方法進行反應，進而確定多重PCR反應的最佳引物比例。

表3 雞、鴨多重PCR預實驗模板比例Table 3 Template proportion of chicken and duck for preliminary PCR μL

1）當引物比例 CD-U1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.15∶0.15時，進行PCR反應，電泳結(jié)果見圖1（a）。

2）當引物比例 CD-U1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.1∶0.25時，進行PCR反應，電泳結(jié)果見圖1（b）。

圖1 不同引物比例的PCR預實驗Fig.1 Different primer proportion of preliminary PCR

由圖1可以顯示，當引物比例CD-U1∶C-L1∶DL1=0.25∶0.15∶0.15時，不論模板量的多少，雞條帶（505 bp）亮度總高于鴨條帶（436 bp），不符合預期結(jié)果；而當引物比例 CD-U1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.1∶0.25時，雞、鴨條帶的亮度隨不同體系中模板量的變化而變化，且在雞、鴨模板量相同的條件下，所擴增條帶亮度一致，符合預期試驗結(jié)果。因此選取引物比例CDU1∶C-L1∶D-L1=0.25∶0.1∶0.25為多重 PCR的引物比例。

3.2 雞、鴨肉成分的鑒定

將所提取的雞、鴨肉和豬肉基因組DNA分別按2.2方法進行PCR檢測，電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 雞、鴨肉鑒定的PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of detecting chicken and duck

陽性對照，陰性對照和空白對照均成立，即雞肉擴增出505 bp的條帶，鴨肉擴增出436 bp的條帶，而豬肉和空白對照中均無條帶。

3.3 雞、鴨肉混合樣品的檢測

雞、鴨混合（即PCR模板中雞肉與鴨肉DNA的比例）依次為（0 ∶1）；（0.1 ∶0.9）；（0.25 ∶0.75）；（0.5 ∶0.5）；（0.75 ∶0.25）；（0.9 ∶0.1）；（1 ∶0）。模板混合均勻后，按2.2方法進行PCR擴增，電泳檢測結(jié)果見圖3所示。

圖3 多重PCR檢測雞鴨肉不同比例的混合模板Fig.3 Multiplex PCR detection of Mixture template containing chicken and duck.

第1泳道（模板完全為鴨肉）為鴨肉436 bp的條帶；第7泳道（模板完全為雞肉）為雞肉505 bp的條帶。第4泳道（雞、鴨模板比例為0.5∶0.5）則同時出現(xiàn)雞肉和鴨肉的條帶，且亮度一致，表明所選取的引物比例合適。整個PCR結(jié)果隨混合模板中雞、鴨DNA量的變化而相應的改變。因此，該多重PCR體系可檢測出混合樣品中雞、鴨肉的比例最低為10%。

3.4 成都市雞、鴨肉的鑒別檢測

分別在成都市的生產(chǎn)、流通和餐飲環(huán)節(jié)隨機抽取雞、鴨肉各30批，用所建立的多重PCR方法進行鑒別，部分（10個批次）檢測結(jié)果見圖4。

圖4 雞、鴨肉鑒別檢測的部分（10批）PCR結(jié)果Fig.4 Partial PCR results of detecting chicken and duck

PCR結(jié)果顯示目前成都市市場上的雞、鴨肉風險度較低，暫無摻偽造假現(xiàn)象。

4 討論

本實驗所選取的雞、鴨特異性引物均位于線粒體Cyt-b上，因為線粒體在動物的各個組織均大量存在，并且Cyt-b基因具有很高的保守性[12]。通過比對雞、鴨的Cyt-b基因序列，確定了針對雞、鴨的特異性檢測引物，并進行了相應引物比例的PCR反應。同時，還對雞、鴨混合模板進行了PCR試驗，結(jié)果表明該方法所建立的多重PCR體系可檢測出混合樣品中雞、鴨肉的比例最低為10%。為了進一步驗證PCR結(jié)果的準確性性，將PCR產(chǎn)物送由華大基因公司進行測序，并將測序結(jié)果與GenBank中雞、鴨的Cyt-b基因進行比對（圖5）。比對結(jié)果顯示，我們所擴增的雞（505 bp）片段和鴨（436 bp）片段確實位于Cyt-b基因上，表明試驗結(jié)果真實可靠。同時，用該方法對成都市場上的雞、鴨肉抽樣檢測顯示，目前市場上暫無雞、鴨肉的摻偽造假現(xiàn)象。

圖5 雞、鴨PCR測序結(jié)果分別與GenBank中Cyt-b基因的序列比對Fig.5 The sequence of PCR results for chicken and duck were compared with Cyt-b gene in Genbank,respectively

由于目前相關(guān)法律法規(guī)沒有明確規(guī)定，要求市場上的肉類制品標示出所含肉類的種類及含量，所以市售的肉制品均只標明成分而不標明各成分含量。在這種情況下，對肉制品中不同種屬的肉類進行定量檢測意義不大，故本試驗中所使用的引物其特異性和靈敏度完全符合市場檢測的要求[10]。因此，本實驗設(shè)計的引物具有特異性強、靈敏度高的特點，建立的PCR檢測方法樣品用量少，結(jié)果準確，適合大規(guī)模推廣應用。

[1] 李文靜,李燕俊.分子學方法鑒定肉制品種屬來源的研究進展[J].國外醫(yī)學：衛(wèi)生學分冊,2009(3)：151-158

[2] 韓敏義,唐明麗.PCR在肉類科學中的應用[J].畜牧與飼料科學,2009,30(9)：57-60

[3] 劉旭輝,馬貴平,史喜菊,等.商品中動物源性成分檢測方法的研究進展[J].物醫(yī)學進展,2007,28(10)：91-94

[4] Dalmasso A,Fontanella E,Piatti P,et al.A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs[J].Mol Cell Probes,2004,18(2)：81-87

[5] 陳文炳,邵碧英,廖憲彪,等.加工食品中若干動物成分的PCR檢測技術(shù)應用研究[J].食品科學,2005,26(8)：338-342

[6]TANABE S,MIYAUCHI E,MUNESHIG A E,et al.Method of detecting pork in foods for verifying allergen labeling and for identifying hidden pork in gradients in processed foods[J].Biotechnol Biochem,2007,71(7)：1663-1667

[7]FUJIMURA T,TANABE S,MORIMATSU F,et al.Specific discrimination of chicken DNA from other poultry DNA in processed foods using the polymerase chain reaction[J].Biotechnol Biochem,2008,72(3)：909-913

[8] Masunaga T,Chikuni K,Tanabe R,et al．A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay[J]．Meat Science,1999,51(2)：143-148

[9] 宗卉,范萬紅,溫燕輝.應用多重PCR同時檢測牛、羊源性成分[J].中國草食動物,2006,26(6)：21-22

[10]孫艷華,張智禹,牛晉陽,等.PCR法快速檢測熟肉制品中肉類來源[J].食品研究與開發(fā),2010,31(5)：139-142

[11]O irfan iLHAK,Ali ARSLAN.Identification of meat species by polymerase chain reaction technique[J].Turk J Anim Sci,2007,31(3)：159-163

[12]Unseld M,Beyermann B,Brandt P,et al.Identification of the species origin of highly processed meat products by mitochondrial DNA sequences[J].Genome Research,1995,4：241-243