于靚+程德勇+熊儒先+繆禮鴻

摘要：以解淀粉芽孢桿菌T1為研究菌種，從5種培養(yǎng)基中選出最有利于其生長(zhǎng)的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并通過(guò)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌T1的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH 7.0，裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、 發(fā)酵時(shí)間36 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)由1.4×109 cfu/mL增加至3.5×109 cfu/mL。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化；活菌數(shù)

中圖分類號(hào)： S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）15-3621-04

Optimizing the Medium and Culture Conditions for the Multiplication of Bacillus amyloliquefaciens T1 Strain

YU Jing，CHENG De-yong，XIONG Ru-xian，MIAO Li-hong

（Shool of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract： Using Bacillus amyloliquefaciens T1 as strain， five well-defined culture media were selected to promote its multiplication. The proportion of each component and the culture condtions were optimized with single factor test and orthogonal test. The results showed that a maximal yield of cell amount could be obtained in the medium containing 1% compound amino acid nutrient solution，1.5% peptone，5% molasses and 2.5% soluble starch. The best cultivation conditions were pH 7.0， bottling volume 80 mL/250 mL， inoculum size of 5%， temperature 37 ℃， shaking speed 180 r/min， culture time 36 h. Compared with the initial conditions， the optimized medium and culture conditions resulted in a remarkable increase of the strain multiplication. The maximum yield of the bacteria cells was improved from 1.4×109 cfu/mL to 3.5×109 cfu/mL.

Key word： Bacillus amyloliquefaciens；medium；optimization；viable count

收稿日期：2014-03-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102805-04）

作者簡(jiǎn)介：于 靚（1985-），女，湖北武漢人，碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物，（電話）13476056651（電子信箱）jing_yu21@163.com；通訊作者，繆禮

鴻（1965-），男，安徽巢縣人，教授，博士，主要從事環(huán)境微生物方面的研究，（電話）13971661012（電子信箱）miaowhpu@126.com。

解淀粉芽孢桿菌是廣泛存在于自然界的一種非致病性細(xì)菌，該菌與枯草芽孢桿菌親緣性很高，次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力較強(qiáng)，能夠分泌抗生素、抗菌蛋白、多肽類物質(zhì)，從而對(duì)多種病原菌、真菌等具有良好的抑制作用[1-4]。如權(quán)春善等[5]從堆肥中分離到一株對(duì)植物病原菌尖孢鐮刀菌具有強(qiáng)抗菌活性的解淀粉芽孢桿菌Q-12；解淀粉芽孢桿菌FZB42對(duì)歐文氏菌引起的梨火疫病具有防治效果[6]。研究表明解淀粉芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)為抑菌蛋白[7，8]。

解淀粉芽孢桿菌T1由武漢輕工大學(xué)資源與環(huán)境微生物研究室分離得到。解淀粉芽孢桿菌T1能夠產(chǎn)生非蛋白質(zhì)類溶藻活性物質(zhì)[9]。這使其具有抑制有害藻，促進(jìn)有益藻生長(zhǎng)的功能。因此解淀粉芽孢桿菌T1菌劑可防治微囊藻水華、修復(fù)養(yǎng)殖水體生態(tài)，還可安全應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)、水產(chǎn)、動(dòng)物飼料中。據(jù)曹海鵬等[10]研究，解淀粉芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水中氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和pH等理化因子的影響均控制在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的安全濃度范圍內(nèi)。本研究從5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇出最有利于解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，并通過(guò)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基，得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方，為其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：解淀粉芽孢桿菌T1由武漢輕工大學(xué)資源與環(huán)境微生物研究室分離獲得。

復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液：總氮含量6.2%、NaCl含量20%。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基配方如表1所示，培養(yǎng)基pH 均為7.0，121 ℃滅菌20 min備用。

1.3 解淀粉芽孢桿菌T1發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇endprint

將活化好的解淀粉芽孢桿菌T1接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將制備好的種子液以5%接種量接種到5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，分別在24、36、48、60 h采用稀釋平板涂布計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，即將菌懸液涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定菌落數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn)

分別測(cè)定接種量、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基裝瓶量、碳源、氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響。①接種量。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0，分別以3%、5%、7%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；②培養(yǎng)基pH。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；③培養(yǎng)基裝瓶量。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0，在250 mL錐形瓶中分別裝60、80、100、120 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；④碳源。選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入到氮源液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為5 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；⑤氮源。選擇牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、尿素和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液5種氮源分別加入到碳源液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為3 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液。

以上各試驗(yàn)接種液在37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)36 h后，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇2種碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2種氮源（蛋白胨、復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液）和3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方，正交試驗(yàn)因素水平如表2所示。

采用SPSS軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌T1發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

將解淀粉芽孢桿菌T1接種到5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布平板法分別測(cè)定在24、36、48、60 h時(shí)解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，解淀粉芽孢桿菌T1在液體發(fā)酵培養(yǎng)基3中發(fā)酵36 h時(shí)活菌數(shù)最大，達(dá)到1.4×109 cfu/mL。因此，以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3和發(fā)酵36 h作為解淀粉芽孢桿菌T1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，達(dá)到最高。因此，選擇接種量為5%。

2.2.2 培養(yǎng)基pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 培養(yǎng)基pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，達(dá)到最高，因此，最適宜解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的pH為7.0。

2.2.3 培養(yǎng)基裝瓶量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 培養(yǎng)基裝瓶量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基裝瓶量為80 mL/250 mL時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為2.3×109 cfu/mL，達(dá)到最高，所用培養(yǎng)基最優(yōu)裝瓶量為80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖5所示。由圖5可知，糖蜜作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最高，為1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為9.0×108 cfu/mL，故選擇糖蜜和可溶性淀粉2種碳源因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基篩選。

2.2.5 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖6所示。由圖6表明，蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最高，為1.6×109 cfu/mL，其次是復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，故選擇蛋白胨和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液2種氮源因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基篩選。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4所示。由表3可知，極差R值的大小為C>B>D>A，即對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的影響由大到小依次為糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液。通過(guò)直觀分析和方差分析，得到A1B3C3D3的組合為最優(yōu)方案。

選擇A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)用LB液體培養(yǎng)基作為參比培養(yǎng)基，發(fā)酵36 h測(cè)定解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)，3次重復(fù)。結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌T1在A1B3C3D3組合中的活菌數(shù)最高，達(dá)到3.5×109 cfu/mL，而在LB液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)僅為7.2×108 cfu/mL，其活菌數(shù)是LB液體培養(yǎng)基活菌數(shù)的4.86倍，是未優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基3活菌數(shù)（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1組合下，其活菌數(shù)分別為2.58×109、2.63×109 cfu/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，故解淀粉芽孢桿菌T1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小結(jié)

從5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇出培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最大的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，再通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優(yōu)培養(yǎng)條件為裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、pH 7.0、溫度37 ℃、180 r/min、發(fā)酵時(shí)間36 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)可達(dá)3.5×109 cfu/mL，為液體發(fā)酵培養(yǎng)基3活菌數(shù)1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

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將活化好的解淀粉芽孢桿菌T1接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將制備好的種子液以5%接種量接種到5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，分別在24、36、48、60 h采用稀釋平板涂布計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，即將菌懸液涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定菌落數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn)

分別測(cè)定接種量、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基裝瓶量、碳源、氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響。①接種量。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0，分別以3%、5%、7%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；②培養(yǎng)基pH。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；③培養(yǎng)基裝瓶量。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0，在250 mL錐形瓶中分別裝60、80、100、120 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；④碳源。選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入到氮源液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為5 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；⑤氮源。選擇牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、尿素和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液5種氮源分別加入到碳源液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為3 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液。

以上各試驗(yàn)接種液在37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)36 h后，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇2種碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2種氮源（蛋白胨、復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液）和3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方，正交試驗(yàn)因素水平如表2所示。

采用SPSS軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌T1發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

將解淀粉芽孢桿菌T1接種到5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布平板法分別測(cè)定在24、36、48、60 h時(shí)解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，解淀粉芽孢桿菌T1在液體發(fā)酵培養(yǎng)基3中發(fā)酵36 h時(shí)活菌數(shù)最大，達(dá)到1.4×109 cfu/mL。因此，以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3和發(fā)酵36 h作為解淀粉芽孢桿菌T1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，達(dá)到最高。因此，選擇接種量為5%。

2.2.2 培養(yǎng)基pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 培養(yǎng)基pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，達(dá)到最高，因此，最適宜解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的pH為7.0。

2.2.3 培養(yǎng)基裝瓶量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 培養(yǎng)基裝瓶量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基裝瓶量為80 mL/250 mL時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為2.3×109 cfu/mL，達(dá)到最高，所用培養(yǎng)基最優(yōu)裝瓶量為80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖5所示。由圖5可知，糖蜜作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最高，為1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為9.0×108 cfu/mL，故選擇糖蜜和可溶性淀粉2種碳源因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基篩選。

2.2.5 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖6所示。由圖6表明，蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最高，為1.6×109 cfu/mL，其次是復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，故選擇蛋白胨和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液2種氮源因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基篩選。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4所示。由表3可知，極差R值的大小為C>B>D>A，即對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的影響由大到小依次為糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液。通過(guò)直觀分析和方差分析，得到A1B3C3D3的組合為最優(yōu)方案。

選擇A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)用LB液體培養(yǎng)基作為參比培養(yǎng)基，發(fā)酵36 h測(cè)定解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)，3次重復(fù)。結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌T1在A1B3C3D3組合中的活菌數(shù)最高，達(dá)到3.5×109 cfu/mL，而在LB液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)僅為7.2×108 cfu/mL，其活菌數(shù)是LB液體培養(yǎng)基活菌數(shù)的4.86倍，是未優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基3活菌數(shù)（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1組合下，其活菌數(shù)分別為2.58×109、2.63×109 cfu/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，故解淀粉芽孢桿菌T1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小結(jié)

從5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇出培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最大的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，再通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優(yōu)培養(yǎng)條件為裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、pH 7.0、溫度37 ℃、180 r/min、發(fā)酵時(shí)間36 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)可達(dá)3.5×109 cfu/mL，為液體發(fā)酵培養(yǎng)基3活菌數(shù)1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

參考文獻(xiàn)：

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將活化好的解淀粉芽孢桿菌T1接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將制備好的種子液以5%接種量接種到5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，分別在24、36、48、60 h采用稀釋平板涂布計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，即將菌懸液涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定菌落數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn)

分別測(cè)定接種量、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基裝瓶量、碳源、氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響。①接種量。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0，分別以3%、5%、7%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；②培養(yǎng)基pH。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；③培養(yǎng)基裝瓶量。以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0，在250 mL錐形瓶中分別裝60、80、100、120 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；④碳源。選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入到氮源液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為5 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；⑤氮源。選擇牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、尿素和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液5種氮源分別加入到碳源液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量均為3 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液。

以上各試驗(yàn)接種液在37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)36 h后，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇2種碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2種氮源（蛋白胨、復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液）和3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方，正交試驗(yàn)因素水平如表2所示。

采用SPSS軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌T1發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

將解淀粉芽孢桿菌T1接種到5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布平板法分別測(cè)定在24、36、48、60 h時(shí)解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，解淀粉芽孢桿菌T1在液體發(fā)酵培養(yǎng)基3中發(fā)酵36 h時(shí)活菌數(shù)最大，達(dá)到1.4×109 cfu/mL。因此，以液體發(fā)酵培養(yǎng)基3和發(fā)酵36 h作為解淀粉芽孢桿菌T1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，達(dá)到最高。因此，選擇接種量為5%。

2.2.2 培養(yǎng)基pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 培養(yǎng)基pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，達(dá)到最高，因此，最適宜解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的pH為7.0。

2.2.3 培養(yǎng)基裝瓶量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 培養(yǎng)基裝瓶量對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基裝瓶量為80 mL/250 mL時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為2.3×109 cfu/mL，達(dá)到最高，所用培養(yǎng)基最優(yōu)裝瓶量為80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖5所示。由圖5可知，糖蜜作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最高，為1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為9.0×108 cfu/mL，故選擇糖蜜和可溶性淀粉2種碳源因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基篩選。

2.2.5 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)的影響如圖6所示。由圖6表明，蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最高，為1.6×109 cfu/mL，其次是復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時(shí)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)為1.4×109 cfu/mL，故選擇蛋白胨和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液2種氮源因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基篩選。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4所示。由表3可知，極差R值的大小為C>B>D>A，即對(duì)解淀粉芽孢桿菌T1生長(zhǎng)的影響由大到小依次為糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液。通過(guò)直觀分析和方差分析，得到A1B3C3D3的組合為最優(yōu)方案。

選擇A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)用LB液體培養(yǎng)基作為參比培養(yǎng)基，發(fā)酵36 h測(cè)定解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)，3次重復(fù)。結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌T1在A1B3C3D3組合中的活菌數(shù)最高，達(dá)到3.5×109 cfu/mL，而在LB液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)僅為7.2×108 cfu/mL，其活菌數(shù)是LB液體培養(yǎng)基活菌數(shù)的4.86倍，是未優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基3活菌數(shù)（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1組合下，其活菌數(shù)分別為2.58×109、2.63×109 cfu/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，故解淀粉芽孢桿菌T1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小結(jié)

從5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇出培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)最大的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，再通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優(yōu)培養(yǎng)條件為裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、pH 7.0、溫度37 ℃、180 r/min、發(fā)酵時(shí)間36 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數(shù)可達(dá)3.5×109 cfu/mL，為液體發(fā)酵培養(yǎng)基3活菌數(shù)1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

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