王改玲　宋云杰　高競鐸

摘要：為探索一種簡單、準確、實用的活菌計數(shù)方法，通過分光光度計和平板計數(shù)法測定地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌4種菌的菌液吸光度和菌液濃度，并建立兩者的線性相關關系。將4種菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h，每1 h取樣1次，每個樣品設3個平行。采用分光光度計（λ=600 nm）測定菌液吸光度（D值），同時采用10倍系列稀釋法測定平皿菌落個數(shù)（CFU）。建立地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌指數(shù)期CFU（y）與D值（x）的回歸方程，分別為y=31.89x+0.561、y=17.71x-0.507、y=18.09x-0.708、y=15.12x-0.270。4種菌穩(wěn)定期的菌液濃度分別約為54×108、29×108、30×108、25×108 CFU/mL。

關鍵詞：分光光度計法；有益菌；活菌數(shù)；吸光度；回歸方程

中圖分類號： S816.73 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0274-02

微生態(tài)制劑（microecologics）即動物食入后在消化道中生長、發(fā)育或繁殖的活體微生物飼料添加劑，具有增強免疫、提高營養(yǎng)的作用，主要包括植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、腸球菌、酵母菌等。微生態(tài)制劑具有防治消化道疾病、降低幼畜死亡率、提高飼料利用率、促進動物生長等作用，并具有無毒副作用、無殘留、不產生抗性等優(yōu)點，可作為安全性較好的飼料添加劑[1]。由于微生物個體較小，測量微生物生長應測量群體的增加量而不是細胞個體大小[2]，從而導致其添加量不易控制。在生產應用中，因添加量過多導致動物患病、添加量不足導致效果不佳的現(xiàn)象時有發(fā)生，影響了養(yǎng)殖業(yè)使用微生態(tài)制劑的積極性。

本研究探索一種實用方法來判斷微生物各階段的數(shù)量，建立快速、簡單、準確的細菌濃度測定方法，以便養(yǎng)殖場合理使用微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）購自國家菌種保藏中心，編號為29212。屎腸球菌（Enterococcus faecium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）均由河南省發(fā)酵工程實驗教學示范中心分離，由南京市金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的培養(yǎng) 將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌4種菌的單個菌落接種于裝有5 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，置于HWS-250型培養(yǎng)箱，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h。

1.2.2 菌液D值的測定 分別將2 mL地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌培養(yǎng)所得種子液接種于 98 mL 營養(yǎng)肉湯中，搖勻后置于37 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。采用721G型可見分光光度計（λ=600 nm）測定4種菌液的D值，每1 h測定1次。

1.2.3 平皿菌落個數(shù)的測定 采用平板計數(shù)法測定平皿菌落個數(shù)。無菌操作取1 mL菌液加入裝有9 mL已滅菌生理鹽水的試管中，混勻后再取1 mL加入下一支試管中，重復以上操作將菌液稀釋至10-1、10-2、……、10-9不同的稀釋度。采用移液槍取200 μL菌液涂布于平板，每個稀釋度涂布3個平板作為平行對照。置于37 ℃下恒溫靜置培養(yǎng)12 h后，采用菌落計數(shù)法進行計數(shù)。

1.2.4 菌液濃度與吸光度關系的建立 以菌落濃度為縱坐標、D值為橫坐標建立4種菌生長曲線，并采用Excel 2007軟件計算生成趨勢線，獲得回歸方程及其相關系數(shù)[3]。

2 結果與分析

2.1 生長周期的測定

測定地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌18 h內的D值，利用Excel 2007軟件繪制細菌的生長趨勢曲線（圖1）。

由測得的D值并結合圖1可得出以營養(yǎng)肉湯為培養(yǎng)基，于pH值7.2、溫度37 ℃條件下生長時，細菌延滯期（lag phase）、指數(shù)期（exponential phase）、穩(wěn)定期（slationary phase）、衰亡期（decline phase）時間與D值的關系（表1）。

2.2 4種菌指數(shù)期濃度與D值的關系

采用Excel 2007軟件處理分析地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌4種菌液指數(shù)期D值與活菌數(shù)的線性回歸方程及相關性系數(shù)，繪制4種菌的活菌數(shù)與D值之間的線性關系。由圖2可知，4種菌的CFU與相應D值線性相關。

由于細菌達到穩(wěn)定期時活菌數(shù)基本保持不變，對穩(wěn)定期的菌液進行抽檢。經實際測定，穩(wěn)定期的活菌數(shù)基本符合指數(shù)期活菌數(shù)的計算公式（表2）。

3 結論與討論

3.1 有益菌添加量的重要性

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌4種有益菌在生長過程中消耗畜禽胃腸道內的氧氣，造成厭氧環(huán)境，促進有益菌群的繁殖；同時增加腸道內酸度，抑制病原菌（沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌）生長，減少機體內條件性致病菌的危害。另外，4種有益菌在生長過程中產生多種營養(yǎng)物質和消化酶，為機體提供營養(yǎng)物質，改善動物消化道微生態(tài)平衡，修復強化腸道黏膜；降低血液和腸道中氨的濃度，并減少向體外生態(tài)環(huán)境的排泄量，改善飼養(yǎng)環(huán)境及生態(tài)環(huán)境[4-8]。

目前，很多規(guī)?；B(yǎng)殖場已開始自己生產微生態(tài)制劑，但微生態(tài)制劑中每種菌的添加量均有一定標準，添加量過多或過少對動物具有極大影響。糞腸球菌添加量過多可能導致動物腸道內菌群的失衡，甚至導致動物死亡；添加量過少則使產品的功能無法達到預期效果，從而影響了微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)生產中的推廣。

3.2 菌液中活菌數(shù)與吸光度的線性關系

微生物在發(fā)酵過程中，指數(shù)期菌液的吸光度與細菌數(shù)表現(xiàn)為極顯著的線性相關關系[9]，在本試驗也可得到驗證。由圖2可知，在以營養(yǎng)肉湯為培養(yǎng)基的菌液中，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌4種菌的活菌數(shù)（y）與吸光度（x）的線性回歸方程分別為y=31.89x+0.561（r=0.989）、y=17.71x-0.507（r=0.987）、y=18.09x-0.708（r=0.993）、y=15.12x-0.270（r=0.995）。4種菌的相關系數(shù)r>0.874，表明以營養(yǎng)肉湯為培養(yǎng)基的4種菌液中，活菌數(shù)與吸光度的相關性極顯著，兩者間呈極顯著的線性相關關系。可見，4種菌處于指數(shù)期的菌液活菌數(shù)可用相應的吸光度來評定。

3.3 分光光度計法的應用

生產過程中使用的有益菌多數(shù)處于穩(wěn)定期和指數(shù)期。在特定培養(yǎng)條件下，處于穩(wěn)定期的活菌數(shù)是相對恒定的（表2）。在實際生產過程中測量菌液濃度時，可通過分光光度計測量菌液的D值，再利用線性關系（表2）計算菌液中的活菌數(shù)，從而準確、便捷地判斷菌液中的活菌數(shù)。

3.4 本方法與傳統(tǒng)方法的比較

在微生態(tài)制劑中，益生菌的添加量是至關重要的因素，因此菌液中活菌數(shù)的測定顯得尤為重要。目前常用的細菌計數(shù)法主要有顯微鏡直接計數(shù)法、平板計數(shù)法、細菌計數(shù)儀法等。

顯微鏡直接計數(shù)操作繁瑣，且包含死菌數(shù)，對試驗人員的技術操作要求高，在生產中應用較少。平板計數(shù)法和細菌計數(shù)儀法對操作人員的技術水平要求較高，檢測工作量大、周期長、成本高，在生產中不便于推廣。

本試驗采用的分光光度計法以平板計數(shù)法為基礎，借助分光光度計測定菌液的D值，達到及時掌握菌液中活菌數(shù)（實時定量）的目的。本方法采用的721G型分光光度計造價低、操作簡單、準確快捷，易于在畜牧業(yè)生產中推廣使用。今后養(yǎng)殖場制作微生態(tài)制劑時，可通過D值確定菌液中的活菌數(shù)。

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