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        不同降解方法制備低分子量硫酸軟骨素的比較

        2014-01-14 09:07:04李燕妮
        化學(xué)與生物工程 2014年3期
        關(guān)鍵詞:軟骨素蘋果酸草酸

        李燕妮

        (濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 煙臺264003)

        硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是關(guān)節(jié)軟骨處蛋白多糖形成所必需的一類糖氨聚糖,廣泛分布于人和一些動物如豬、牛、羊、魚等的軟骨、臍帶和血管壁等組織中,其分子量為15 000~55 000。一般認為,分子量小于常規(guī)值的某個特定分子量或分子量范圍的硫酸軟骨素為低分子量硫酸軟骨素,其不僅具有優(yōu)越的藥理作用和治療效果,并且口服劑量較?。?]。

        目前降解硫酸軟骨素的方法主要有4類[2-3]:硫酸軟骨素裂解酶降解、氧化劑降解、酸降解和堿降解。作者在此選取技術(shù)路線簡單、易于工業(yè)化、生產(chǎn)成本低的過氧化氫降解法、草酸降解法和蘋果酸降解法進行了比較研究。

        1 實驗

        1.1 材料、試劑與儀器

        牛氣管來源硫酸軟骨素,自制。

        草酸、蘋果酸、過氧化氫及其它試劑均為市售分析純。

        Waters液相色譜儀;高速冷凍離心機(德國Heraeus公司);電熱恒溫水浴鍋;Ne-XIIS-870型紅外光譜儀。

        1.2 方法

        1.2.1 過氧化氫降解法

        取1 000mL濃度為2%的硫酸軟骨素溶液,加入Cu(OAc)2·H2O至濃度為0.002mol·L-1,在50℃下加入20mL H2O2,攪拌反應(yīng)12h(期間用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0~8.0),加入過氧化氫酶去除未反應(yīng)的H2O2,加入8BV 95%乙醇沉淀出低分子量硫酸軟骨素,離心后烘干得終產(chǎn)品。

        1.2.2 草酸降解法

        取1 000mL濃度為2%的硫酸軟骨素溶液,加入草酸至濃度為0.1mol·L-1,在79~81℃下攪拌反應(yīng)12h,用足量碳酸鈣終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH值為6.5,加入8BV 95%乙醇沉淀出低分子量硫酸軟骨素,離心后烘干得終產(chǎn)品。

        1.2.3 蘋果酸降解法

        取1 000mL濃度為2%的硫酸軟骨素溶液,加入蘋果酸至濃度為0.1mol·L-1,在79~81℃下攪拌12h,用足量碳酸鈣終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH值為6.5,加入8BV 95%乙醇沉淀出低分子量硫酸軟骨素,離心后烘干得終產(chǎn)品。

        1.3 分析與測試

        硫酸軟骨素分子量采用《中國藥典》(2010版)中高效液相色譜法測定。

        紅外吸收光譜測試:KBr壓片,4000~400cm-1波數(shù)范圍掃描。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 3種降解方法制備的低分子量硫酸軟骨素的分子量及收率比較

        過氧化氫降解法、草酸降解法、蘋果酸降解法制備的低分子量硫酸軟骨素的分子量及收率比較見表1。

        表1 3種降解方法制備的低分子量硫酸軟骨素的分子量及收率比較Tab.1 Comparison of the molecular weights and yields of low molecular weight CS prepared by three different degradation methods

        由表1可知,反應(yīng)12h后,過氧化氫降解法和草酸降解法制得的低分子量硫酸軟骨素分子量較低,較原料分子量降低了86%~88%,其中大約含有6~8個硫酸軟骨素雙糖單位(D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖);蘋果酸降解法所得產(chǎn)品,較原料分子量降低了55%。由表1還可知,草酸降解法和蘋果酸降解法的收率明顯高于過氧化氫降解法,這體現(xiàn)了酸法降解的優(yōu)勢。

        2.2 3種降解方法降解硫酸軟骨素的速度比較(圖1)

        圖1 3種降解方法降解硫酸軟骨素的速度比較Fig.1 Comparison of the degradation speeds of CS degraded by three different methods

        由圖1可知,采用過氧化氫降解法,Cu2+催化下硫酸軟骨素的降解速度非???,0.5h內(nèi)即可完成降解,從時間上控制反應(yīng)較為困難,不適宜制備特定分子量的低分子量硫酸軟骨素。如果沒有Cu2+催化,過氧化氫降解法需要很高的溫度(如90℃),并且經(jīng)過大約10h才能開始降解反應(yīng)。草酸降解法在前3h的降解速度較快,在6h時基本完成降解。蘋果酸降解法較其它兩種方法反應(yīng)更溫和,且降解過程中分子量與時間的線性關(guān)系較好,因此,反應(yīng)更易于控制,容易得到所需分子量的產(chǎn)品。

        2.3 3種降解方法制備的低分子量硫酸軟骨素的紅外光譜比較(圖2)

        圖2 3種降解方法制備的低分子量硫酸軟骨素的紅外光譜比較Fig.2 Comparison of the infrared spectra of low molecular weight CS prepared by three different degradation methods

        硫酸軟骨素主要是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖構(gòu)成的雙糖單位聚合體,硫酸基則與雙糖單位的半乳糖在4位或6位連接形成4-硫酸軟骨素或6-硫酸軟骨素,因此,硫酸軟骨素中含有羧基、乙酰氨基、硫酸基、糖環(huán)等基團。通過紅外光譜分析,證實了這些基團在硫酸軟骨素中的存在。

        由圖2可知,不同降解方法所得產(chǎn)品的紅外光譜沒有明顯的差異,可以初步認為,3種降解方法并未對硫酸軟骨素中的基團造成破壞。

        3 結(jié)論

        對過氧化氫降解法、草酸降解法、蘋果酸降解法等3種降解方法進行比較研究表明,3種方法都可以用于制備低分子量硫酸軟骨素,所得產(chǎn)品的分子量差別較大,其中過氧化氫降解法和草酸降解法所得產(chǎn)品的分子量較??;草酸降解法和蘋果酸降解法所得產(chǎn)品的收率較高;蘋果酸降解法降解過程最溫和,易于控制;3種方法所得產(chǎn)品的紅外光譜未見明顯差別。

        [1]ADEBOWALE A,DU J.The bioavailability and pharmacokinetics of glucosamine hydrochloride and chondroitin sulfate after oral and intravenous single dose administration in the horse[J].Biopharm Drug Dispos,2002,23(6):217-225.

        [2]CHO S Y,SIM J S,TEONG C S,et al.Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on typeⅡcollagen-induced arthritis in DBA/1Jmice[J].Biol Pharm Bull,2004,27(1):47-51.

        [3]TAKEBIKO K,TADAKAZU S,YOSHIRO Y.Low molecular chondroitin sulfate and method for manufacturing the same:US,3405120A[P].1968-10-08.

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