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        大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的研究

        2014-03-29 01:33:29月,李
        化學(xué)與生物工程 2014年3期
        關(guān)鍵詞:款冬花大孔純度

        李 月,李 喆

        (1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,遼寧 沈陽(yáng) 110001;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥品管理部,吉林 長(zhǎng)春 130041)

        款冬花為菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾。味辛、微苦,性溫。具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰的功效,主治新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血[1]。現(xiàn)代藥理研究表明,款冬花有支氣管解痙、中樞興奮、鎮(zhèn)痛抗炎、抗血小板聚集等作用,款冬二醇、蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物為其有效成分[2]。大孔吸附樹脂用于中藥制藥技術(shù)已日趨成熟,在中藥材有效部位的富集方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。作者在此進(jìn)行了大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的研究。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 材料、試劑與儀器

        款冬花藥材購(gòu)于沈陽(yáng)天益堂,經(jīng)鑒定為菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾,粉碎過40目篩,80 ℃烘干,備用。

        蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080-200306),中國(guó)食品藥品檢定研究院;D101、HPD300、HPD600型大孔吸附樹脂,河北滄州寶恩化工有限公司;X-5、AB-8型大孔吸附樹脂,天津南開大學(xué)化工廠;其它試劑均為分析純;水為純化水。

        紫外可見分光光度計(jì),恒溫水浴振蕩器,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品液制備與總黃酮含量測(cè)定

        取款冬花粉于錐形瓶中,用60%乙醇按液料比20∶1(mL∶g,下同)浸泡10 min,微波處理(微波功率300 W,處理時(shí)間9 min),過濾,減壓濃縮,用石油醚萃取至醚層無(wú)色(除去葉綠素),即得款冬花樣品液(其中總黃酮含量為2.76 mg·mL-1),備用。

        用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統(tǒng)發(fā)生顯色反應(yīng),用分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定款冬花總黃酮含量[3]。以蘆丁為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:A=9.7511c+0.0065(R=0.9993),線性范圍為13.2~66.0 μg·mL-1。

        1.2.2 樹脂的篩選

        將15 mL預(yù)處理過的不同型號(hào)濕樹脂置于具塞錐形瓶中,各加樣品液30 mL,置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h,過濾,測(cè)定濾液中總黃酮含量,計(jì)算靜態(tài)吸附量。再將已吸附款冬花總黃酮的樹脂置于具塞錐形瓶中,各加入60%乙醇30 mL,置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩2 h,過濾,測(cè)定解吸液中總黃酮含量,計(jì)算解吸率。

        式中:m0為吸附前樣品液的總黃酮含量;m1為吸附后濾液的總黃酮含量;V為樹脂體積;m2為解吸液的總黃酮含量。

        1.2.3 AB-8大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的工藝參數(shù)優(yōu)化

        將4 BV的款冬花樣品液以3 BV·h-1的上樣流速通過樹脂柱(1 BV約為20 mL),動(dòng)態(tài)吸附40 min;用4 BV純化水以1 BV·h-1的速度沖洗至幾乎無(wú)色,再用4 BV 60%乙醇以4 BV·h-1的速度洗脫至幾乎無(wú)色,收集洗脫液,回收乙醇,計(jì)算洗脫液中款冬花總黃酮的純度及回收率。

        通過單因素實(shí)驗(yàn),依次考察上樣量(上樣速度為1 BV·h-1)、上樣速度、吸附時(shí)間、純化水用量、純化水沖洗速度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量對(duì)總黃酮純度和回收率的影響,確定優(yōu)化的富集工藝。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 樹脂篩選結(jié)果(表1)

        表1 5種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附、解吸參數(shù)

        由表1可見,AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)款冬花總黃酮的靜態(tài)吸附量和解吸率均最高。因此,選用AB-8型大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮。

        2.2 AB-8型大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的影響因素

        2.2.1 上樣量

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),上樣量為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV時(shí),總黃酮的純度分別為70.5%、71.3%、72.1%、68.7%、65.8%,回收率分別為88.0%、89.2%、92.8%、74.3%、66.1%??梢?,上樣量為4 BV時(shí),AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)款冬花總黃酮的富集效果最好,且避免了樹脂過飽和造成的黃酮成分流失。因此,確定適宜的上樣量為4 BV。

        2.2.2 上樣速度

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),上樣速度為1 BV·h-1、2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1時(shí),總黃酮的純度分別為72.0%、72.3%、72.5%、64.5%,回收率分別為92.3%、91.3%、92.0%、79.8%??梢姡蠘铀俣冗^快,款冬花總黃酮成分流失較多;上樣速度過慢,操作時(shí)間又太長(zhǎng)。因此,確定適宜的上樣速度為3 BV·h-1。

        2.2.3 吸附時(shí)間

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),吸附時(shí)間為20 min、40 min、60 min時(shí),總黃酮的回收率分別為77.6%、89.3%、84.4%??梢?,吸附時(shí)間過短,黃酮成分未充分吸附;吸附時(shí)間過長(zhǎng),出現(xiàn)“死吸附”現(xiàn)象。因此,確定適宜的吸附時(shí)間為40 min。

        2.2.4 純化水用量

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),純化水用量為2 BV、4 BV、6 BV時(shí),總黃酮的純度分別為56.2%、72.2%、72.4%,回收率分別為87.7%、90.6%、79.3%??梢?,水用量過少,雜質(zhì)未完全除去,影響洗脫液中總黃酮的純度;水用量過多,易造成黃酮成分損失。因此,綜合考慮富集效果、總黃酮的回收率和節(jié)約用水等因素,確定適宜的純化水用量為4 BV。

        2.2.5 純化水沖洗速度

        實(shí)驗(yàn)利用黃酮類化合物與氯化鋁反應(yīng)生成黃色熒光絡(luò)合物的性質(zhì)[4],對(duì)水洗液進(jìn)行薄層檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),純化水沖洗速度為2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1時(shí),薄層檢測(cè)均無(wú)異常,但沖洗速度達(dá)8 BV·h-1時(shí),水洗液的薄層檢測(cè)呈淡黃色熒光,說(shuō)明出現(xiàn)了黃酮成分的流失。因此,為了既保證總黃酮的回收率又節(jié)約操作時(shí)間,確定適宜的純化水沖洗速度為6 BV·h-1。

        2.2.6 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%時(shí),總黃酮的回收率分別為51.1%、78.1%、91.4%、90.1%、89.3%,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%~80%時(shí)無(wú)明顯差異。因此,確定適宜的洗脫劑為60%乙醇。

        2.2.7 洗脫劑乙醇用量

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),洗脫劑乙醇用量為3 BV、4 BV、5 BV時(shí),總黃酮的回收率分別為77.3%、92.6%、93.2%。綜合考慮生產(chǎn)成本與生產(chǎn)周期,確定適宜的洗脫劑乙醇用量為4 BV。

        2.3 AB-8型大孔吸附樹脂的穩(wěn)定性

        將處理好的AB-8型大孔吸附樹脂濕法裝柱,取4 BV的款冬花樣品液以3 BV·h-1的流速上柱吸附40 min,用4 BV的純化水以6 BV·h-1的速度沖洗雜質(zhì),再用4 BV的60%乙醇洗脫,收集洗脫液,測(cè)定總黃酮的純度和回收率,重復(fù)進(jìn)行以上操作。結(jié)果,進(jìn)行到第7次實(shí)驗(yàn)時(shí),總黃酮的純度和回收率均大幅下降,分別為48.7%和70.3%。表明,AB-8型大孔吸附樹脂可以連續(xù)使用6次,之后需要進(jìn)行再生處理。

        2.4 討論

        1)預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),洗脫劑的洗脫速度不同時(shí)的富集效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

        2)有文獻(xiàn)報(bào)道,樹脂柱的徑高比也是影響富集效果的因素之一。但受實(shí)驗(yàn)室儀器安裝等具體條件的限制,本實(shí)驗(yàn)未能對(duì)樹脂柱徑高比進(jìn)行考察。

        3 結(jié)論

        通過靜態(tài)吸附、解吸的篩選實(shí)驗(yàn),確定富集款冬花總黃酮的樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。通過單因素實(shí)驗(yàn),以富集后總黃酮的純度和回收率為指標(biāo),確定款冬花總黃酮適宜的富集工藝為:將4 BV款冬花樣品液以3 BV·h-1的速度上樣,吸附40 min,用4 BV的純化水以6 BV·h-1的速度沖洗雜質(zhì),再用4 BV的60%乙醇洗脫總黃酮。該樹脂穩(wěn)定性良好,可連續(xù)使用6次。此富集工藝簡(jiǎn)單、可行,富集所得款冬花總黃酮的純度和回收率均較高,為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

        [1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:312.

        [2] 呂培霖,李成義,翟麗芳.款冬花化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2007,18(12):948-949.

        [3] 宋宏新,楊芳.大孔吸附樹脂分離貫葉連翹中黃酮類化合物[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,31(5):645-647.

        [4] 騰坤,阮洪生,武子敬,等.大孔吸附樹脂純化藤梨根中總黃酮工藝優(yōu)選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(1):63-65.

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