Osama A O Elhag，宋 旗，鄭龍玉，喻子牛，張吉斌

（1.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室 微生物農藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.Department of Biotechnology－Sc.＆Tech－Omdurman Islamic University，Sudan）

昆蟲是動物世界種類數(shù)目最龐大的一類。目前，除了極地和深海，昆蟲能在大多數(shù)的生物生境被發(fā)現(xiàn)。超過一百萬的昆蟲物種已被鑒定，且約有同等數(shù)量的種類仍有待確定。昆蟲的抵抗病原體能力必然有助于其大量增殖和多樣性。昆蟲的免疫系統(tǒng)具有一些共同的特點，沒有發(fā)現(xiàn)類似于高等動物中的特異性免疫系統(tǒng)。由于缺乏B和T淋巴細胞以及無免疫球蛋白和補體，使得昆蟲進化出有效和復雜的先天免疫系統(tǒng)，這明顯不同于脊椎動物的適應性免疫系統(tǒng)。昆蟲抗菌肽（AMPs）是昆蟲免疫系統(tǒng)的一個關鍵部分，主要由脂肪體合成，其功能類似于哺乳動物的肝臟［1］。

抗菌肽的生物學功能包括抗細菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗腫瘤和抗病毒活性等。作為先天免疫系統(tǒng)的抗感染的重要組成成分，從自然界的昆蟲和植物到高度進化的有更復雜免疫系統(tǒng)的動物，均廣泛表達抗菌肽［2］。到目前為止，已有成百上千的抗菌肽被報道，它們中的大多數(shù)來自不同的有機體，但具有共同的性質，如分子量小、帶正電荷、在疏水性的環(huán)境中具兩親性等?？咕拇笾驴苫诠餐亩壗Y構模體分為5組：兩親性含α螺旋的肽、分子內有二硫鍵的肽、溶解酵素的肽、富含甘氨酸的肽和富含脯氨酸的肽［3］。來源于昆蟲的抗菌肽通常是帶陽離子的，一般少于100個氨基酸。從不同昆蟲分離的抗菌肽的分類取決于它們的同族性，主要有cecropins、attacins、lysozymes、defencins和dipteracins［4］。Boman團隊從羅賓蛾（Hyalophora cecropia）免疫性蛹的血淋巴純化出第一個抗菌肽。研究者已從雙翅目昆蟲分離出了5個類型的抗菌肽，從果蠅中分離出的7個不同類型的抗菌肽（包括cecropins、drosocin、attacins、dipteracins、defensin、drosomycin和metchnikowins）已通過全基因組微陣列分析鑒定和表征［4］。

抗菌肽的作用機制是非常復雜的，包括破壞細胞膜、作用細胞質成分與干擾代謝［5］等。作者在此對已發(fā)現(xiàn)的昆蟲抗菌肽的作用機制及其應用進行了綜述。

1 作用機制

目前，研究已證實抗菌肽可通過與微生物陰離子表面的相互作用和插入到磷脂組成的細胞膜來發(fā)揮作用。這一作用導致對細胞膜完整性的破壞，如去極化和孔隙的形成。此外，最近報道某些昆蟲抗菌肽通過不同的機制產生抗菌活性，包括對細胞呼吸的抑制、細胞壁形成的抑制、細菌蛋白失活和誘導酵母凋亡。

1.1 破壞細胞膜的機制

陽離子抗菌肽與磷脂結合時，抗菌肽與細胞膜的相互作用開始。當抗菌肽與脂質的比例較低時，與陽離子抗菌肽相關聯(lián)，多肽將平行于膜的平面，插入在親水脂質頭部基團和疏水脂肪鏈的界面。然而，隨著肽脂比的增大，這些多肽能夠在細胞膜聚集或重新定位而破壞其完整性。這通常通過3個假設的模型之一來實現(xiàn)：筒壁模型、地毯模型和環(huán)形孔模型。在筒壁模型中，許多螺旋肽單體聯(lián)合形成孔隙造成膜的破壞；在地毯模型中，肽結合在膜表面并通過形成環(huán)形孔而破壞膜結構；在環(huán)形孔模型中，肽與膜脂質頭部基團結合引起膜的減?。?］。

透射電子顯微觀察發(fā)現(xiàn)，昆蟲防御素（defensin）對革蘭氏陽性菌藤黃微球菌（Micrococcus luteus）的作用導致了胞質膜被溶解和細胞質內含物的泄漏。表明defensin作用的基本機制是細菌胞膜溶解［7］。來自伏蠅（Phormia terranova）幼蟲血液的重組昆蟲defensin對藤黃微球菌的作用機制已被闡明。結果表明，防御素造成細胞質鉀的損失、部分內膜去極化、細胞質ATP減少和呼吸抑制，這主要由于電壓依賴性通道的形成導致細菌細胞質膜的通透性發(fā)生改變［8］。van den Bogaart等［9］研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒素引起由兩性離子二油酰磷脂酰膽堿（DOPC）脂質組成的脂質體的兩種效應：其一，肽－孔隙形成導致囊泡內含物的泄漏；其二，當蜂毒肽附著在非活性構象的膜表面時保護膜免受泄漏，從而防止其它蜂毒肽分子插入到雙分子層。細胞壁溶解酶是受感染的鱗翅目昆蟲溶菌酶，該酶可水解細菌細胞的肽聚糖層中的N－乙酰葡糖胺和N－乙酰胞壁酸殘基的β－1，4－糖苷鍵，并引起細胞溶解［4］。

抗菌肽attacins通過抑制外膜蛋白合成活性來抑制革蘭氏陰性菌，而抗菌肽moricin通過增加細胞膜的通透性來殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌［4］。Wang等［10］研究顯示，從黃蜂（Polybia paulista）的毒液中分離純化得到的抗菌肽polybia－MPI的作用靶標是細菌的膜，通過破壞膜的完整性，最終導致細胞內含物滲漏。此外，對polybia－MPI與DNA結合特性的研究表明，它沒有與DNA結合，證實polybia－MPI是以細胞膜為目標發(fā)揮其抗菌活性。

某些抗菌肽通過改變細胞膜的完整性殺滅真菌，如cecropins，其在殺菌劑量下沒有表現(xiàn)對哺乳動物細胞的毒性，已被證明對動物安全［11］。白蟻（Pseudacanthotermes spiniger）產生的抗菌肽spinigerin的作用模式與非洲爪蟾產生的抗菌肽magainin 2相似，是通過增加膜通透性來抗菌的［12］。

1.2 非膜破壞性的機制

雖然大多數(shù)昆蟲抗菌肽與細胞膜相互作用并影響細胞膜的完整性，但膜通透性增加是否是主要的致死因素或細胞膜是否是唯一作用部位尚不清楚。有許多抗菌肽采用不同的非膜破壞性的作用模式。昆蟲產生的麻蠅素－Ⅱ（sarcotoxinsⅡ）和β－defensin－3均能抑制細胞壁生成，以阻止細菌正常細胞形態(tài)的形成，但對已經存在的細胞壁沒有作用［13］。昆蟲類抗菌肽如pyrrhocoricin、apidaecin和drosocin，被認為是通過進入細胞內抑制分子伴侶DnaK生成來殺死細菌。Otvos等提出L－pyrrhocoricin（L－PYR）結合到DnaK上的非傳統(tǒng)的結合位點，也就是αE和αD螺旋多層螺旋蓋的亞結構域，并且L－PYR阻止了DnaK的蓋子打開和關閉［14］。

刺盲椿（Podisus maculiventris）產生的抗菌肽thanatin不改變細菌膜的通透性，而是導致細菌細胞的凝集。這種抗菌肽的D－對映異構體不具有抗細菌活性，但仍然具有抗真菌活性［12］。研究表明，抗菌肽thanatin殺死細菌是通過抑制細胞呼吸，而不是影響細胞膜，當以不同濃度的thanatin處理細菌細胞時，沒有檢測到K＋向外流動，這一現(xiàn)象表明細胞膜不是該抗菌肽的靶標。而增加thanatin濃度（40μmol·L－1），處理1h后，能減弱細胞呼吸，6h后呼吸完全停止［5］。

抗菌肽天蠶素A對大腸桿菌的非致死性影響是通過對其細胞內少數(shù)基因轉錄水平的改變實現(xiàn)的［15］。attacins通過干擾外膜蛋白基因的轉錄，從而減少這些蛋白質的含量，增加細胞膜的通透性，最終抑制細菌的生長［5］。DNA作為遺傳信息的載體，在生理過程中起著重要的作用?？咕呐cDNA的相互作用引起了研究者的關注。研究發(fā)現(xiàn)，某些昆蟲抗菌肽能與細菌的DNA結合，影響其正常的生理功能。如家蠶抗菌肽cecropin能夠結合質粒pECP1DNA，凝膠遷移率變動分析表明其遷移率受到影響［5］。

2 抗菌肽的應用

目前，由于抗生素的過度使用導致了許多耐藥菌的產生［16］，而多種抗生素耐藥的細菌病原體可被昆蟲抗菌肽拮抗［17］，因而對有效的抗菌肽藥物的需求大量增加?？咕淖鳛槌Ｒ?guī)抗生素新的替代品［5］具有許多理想的特性，如生產成本低、作用速度快、耐高溫、抗菌譜較廣、對真核細胞的毒性低等，可以不同的方式作為抗菌劑或治療劑發(fā)揮作用：可用作單一的抗菌劑；可結合其它抗菌劑提高抗菌活性；能夠增強病人的免疫系統(tǒng)；可作為感染性休克內毒素的中和劑。到目前為止，AMPs作為單獨的抗菌劑使用最受關注，作為經典抗生素治療的輔助物和內毒素中和劑也得到較多研究。

天蠶素（cecropins）是最初發(fā)現(xiàn)產自天蠶蛾的多肽，主要對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌［4］以及真菌有抗菌活性，當cecropins使用量在25～100μg·mL－1時無法拮抗病原性的曲霉菌病。串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）對cecropin A特別敏感，濃度為12.4μg·mL－1時可以完全殺滅［11］。昆蟲防御素對革蘭氏陽性菌有很高的活性，但對革蘭氏陰性菌的拮抗活性不高［5］。

果蠅產生的一種防御素drosomycin和從十字花科種子純化得到的抗真菌肽相似，其在結構上類似于蘿卜抗真菌肽Rs－AFP1，主要對尖孢鐮刀菌菌株起作用［11］。Yamada等研究表明，從日本甲蟲分離得到的防御素對抗生素甲氧西林有抗藥性的金黃葡萄球菌菌株有拮抗活性。D2A21是cecropins的模擬肽，對感染創(chuàng)面的治療比標準治療更加有效，接受D2A21治療的大鼠長期生存率達100%，而對照組只有50%［4］。從昆蟲提取的抗真菌肽包括thanatin和holotricin 3。富含組氨酸的抗真菌肽導致細胞內含物泄漏。這些抗真菌肽是從肉蠅（Sarcophagaperegrina）的第三齡幼蟲血淋巴中分離得到的，體外實驗證實其對白色念珠菌（Candida albicans）有拮抗作用。斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）產生的抗菌肽thanatin能有效抑制尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和煙曲霉（Aspergaillus fumigatus）而無溶血作用。從東北大黑鰓金龜（Holotrichia diomphalia）幼蟲的血淋巴純化得到一種富含甘氨酸和組氨酸的肽holotricin 3，能抑制白色念珠菌的生長［11］。

Chernysh等［18］研究表明，從紅頭麗蠅（Calliphora vicina）中分離的抗菌肽alloferons可與流感病毒血凝素蛋白進行競爭，干擾病毒組裝甚至阻止病毒吸附于細胞，從而降低感染流感病毒小鼠的死亡率。研究者通過改變蜂毒肽電荷的分布情況得到了1個非常成功的蜂毒肽衍生物Hecate，保持了其三維結構。Hecate表現(xiàn)出抗單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV－1）的效果，可以在相對較低的濃度下減少血小板的形成，但不干擾病毒的蛋白合成過程。據(jù)報道，Hecate能阻止HSV－1誘導的細胞融合和病毒的傳播［19］。

研究證明抗菌肽cecropin通過抑制艾滋病毒HIV－1基因的活性或降低病毒基因轉錄水平，能減少HIV－1對細胞的進一步感染。來自于甲蟲（Allomyrina dichotoma）的抗菌肽defensin的人工衍生物有抗菌和抗炎活性?？咕哪茏柚怪嗵牵↙PS）與位于巨噬細胞表面上的受體進行相互作用，也可阻止α－腫瘤壞死因子（TNF－α）的產生［3］。從紅頭麗蠅分離的低分子量的抗菌肽alloferon可刺激小鼠產生干擾素以及激發(fā)小鼠脾淋巴細胞的細胞毒性作用［18］。

半翅目昆蟲產生的抗菌肽thanatin對多藥耐藥的肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌有高效抑制作用。這些菌株能夠通過改變細胞膜的通透性抵抗不同結構抗生素的效果。thanatin通過改變細菌細胞膜對抗生素的通透性或迫使細菌形成具有特殊結構的細胞膜，從而增強抗生素對這些耐藥株的作用。細菌和腫瘤細胞膜的共同特征是帶負電荷［20－21］。由于腫瘤細胞膜含有一定數(shù)量帶負電荷的磷脂酰絲氨酸，因而比正常細胞多帶3%～9%的負電荷［22］。通過轉化部分L型氨基酸生成D－對映體得到蜂毒肽衍生物，新的抗菌肽具有高效腫瘤抑制作用而無溶血作用。蜂毒肽類似物Hecate被認為對乳腺癌細胞具有殺傷作用［3］。Hecate通過與激素結合產生共軛Hecate激素來實現(xiàn)有效傳播的，其受體如促黃體生成激素位于細胞表面，同時Hecate的細胞選擇性也會提高［18］。在異色瓢蟲（Harmonia axyridis）產生的像防御素defensin的抗菌肽harmoniasin的人工二聚體肽類似物中，HaA4被發(fā)現(xiàn)有很高的抗菌活性且尚未發(fā)現(xiàn)溶血活性，還被認為可以作為人白血病的有效治療劑［23］。

3 結語

隨著抗生素在醫(yī)藥、農業(yè)和食品工業(yè)的廣泛使用，多耐藥性細菌不斷增加，使得傳統(tǒng)的抗生素失去效果或效果有限，因此迫切需要開發(fā)新的抗生素。天然抗菌肽是先天免疫能迅速應對不同病原微生物的重要元素［2］，具有耐熱性好、抗菌譜較寬、對真核細胞毒性低等性能［3］，目前病原對抗菌肽的抗性十分罕見，因而抗菌肽被認為具有替代傳統(tǒng)抗生素的前景。昆蟲是抗菌肽的重要來源，昆蟲抗菌肽可以作為一個潛在的人類和動物藥物的重要來源［5］。雖然研究者從不同昆蟲中鑒定了大量抗菌肽，但部分昆蟲抗菌肽的作用機制還不完全明確，仍需進一步加深加強相關研究，以推進昆蟲抗菌肽藥物的開發(fā)和應用［24－25］。

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