劉郭飛，伍 林，童 玲，楊立峰，李 丹，童 坤，薩仁高娃，易德蓮

（1.武漢科技大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，湖北 武漢430081；2.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430223；3.日本北見工業(yè)大學(xué)生物材料大學(xué)院，日本 北見0900061）

大豆及大豆制品是我國(guó)以及其它亞洲國(guó)家的傳統(tǒng)食品，大豆中含有豐富的油脂和植物蛋白，其中大豆異黃酮具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而且能預(yù)防和治療多種疾病。到目前為止，從大豆中提取分離出的大豆異黃酮的異構(gòu)體共有12種，主要的有6種，分為結(jié)合型糖苷和游離型苷元，糖苷主要以黃豆苷（daidzin）、黃豆黃苷（glycitin）、染料木苷（genistin）的形式存在，而苷元主要以黃豆苷元（daidzein）、黃豆黃素（glycitein）和染料木黃酮（genistein）的形式存在［1－2］。大豆異黃酮（soybean isoflavones）是一種具有生物活性的植物雌激素，可以降低骨質(zhì)疏松［3］、乳腺癌、更年期綜合癥［4－6］的發(fā)生幾率。另外，還具有抑菌［7］、提高免疫力［8］、降低膽固醇［9］和改善動(dòng)脈硬化的作用［10］。近幾年還有研究證實(shí)大豆異黃酮具有抗高尿酸癥［11］和降血糖［12］的作用。但是過量的大豆異黃酮也會(huì)帶來負(fù)面影響，最近有研究指出大豆異黃酮作為植物激素過量使用時(shí)對(duì)小鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生了負(fù)面影響［13］。因此，大豆異黃酮的含量檢測(cè)十分重要。2001年，AOAC（美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)）公布了大豆及大豆制品中異黃酮的測(cè)定方法。作者在此淺析了AOAC方法的實(shí)驗(yàn)條件和方法，希望能對(duì)國(guó)內(nèi)大豆異黃酮的檢測(cè)起一定的指導(dǎo)作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

大豆樣品（黑龍江產(chǎn)），市售，磨碎后于干燥環(huán)境中保存待用。

甲醇（分析純）、冰醋酸（色譜純）、氫氧化鈉（分析純）、甲醇（色譜純），關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社；黃豆苷、黃豆苷元、染料木苷、染料木黃酮、黃豆黃苷、黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），長(zhǎng)良科技株式會(huì)社。

1.2 主要儀器

LC－10AT型高效液相色譜系統(tǒng)（SCL－10A型系統(tǒng)控制系統(tǒng)，SIL－10A型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，SPD－10A型紫外檢測(cè)系統(tǒng)，CTO－10A型柱溫箱系統(tǒng)），日本SHIMADZU；EDU－1200型冷凍干燥機(jī)、NVC－2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、NTS－2000型恒溫振蕩器，日本EYELA；HIMAC CF 15R型高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI；MDF－392型超低溫冰箱，日本SANYO；ML－50型加熱干燥式水分測(cè)試計(jì)，日本AND株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

按AOAC方法進(jìn)行［14］。準(zhǔn)確稱取5.00g大豆樣品粉末，加入80%甲醇溶液40mL，于65℃水浴中振蕩2.0h，冷卻至室溫后加入3mL 2mol·L－1氫氧化鈉溶液，于室溫水浴中振蕩10min；然后加入1mL冰醋酸，用甲醇定容至50mL，取定容后5mL上清液，加入4mL水，再次用甲醇定容至10mL，取上清液于1 500 r·min－1離心10min，取適量上清液用0.2nm過濾膜過濾后轉(zhuǎn)入液相色譜瓶中待檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.3.2 HPLC條件

色譜柱為Inertsil ODS－4色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；柱溫40℃；流動(dòng)相A為V水∶V甲醇∶V醋酸＝44∶5∶1，流動(dòng)相B為V甲醇∶V醋酸＝49∶1，流速1 mL·min－1；梯度洗脫條件：0～30min，10%～60%B；30～33min，60%～100%B；33～35min，100%B；35～37min，100%～10%B；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按AOAC方法進(jìn)行。稱取6種標(biāo)準(zhǔn)品約1mg于10mL容量瓶中，用80%甲醇溶液溶解，定容，配成約0.1mg·mL－1的母液，搖勻儲(chǔ)藏待用。黃豆苷、染料木苷分別用母液配成濃度約為10mg·mL－1、20mg·mL－1、40mg·mL－1、60mg·mL－1、80mg·mL－1、100mg·mL－1的濃度梯度待測(cè)，黃豆黃苷、黃豆苷元、染料木黃酮分別用母液配成濃度約為1mg·mL－1、4mg·mL－1、8mg·mL－1、12mg·mL－1、16 mg·mL－1、20mg·mL－1的濃度梯度待測(cè)，黃豆黃素用母液配成濃度約為0.6mg·mL－1、0.8mg·mL－1、1.0mg·mL－1、1.2mg·mL－1、1.4mg·mL－1、1.6mg·mL－1的濃度梯度待測(cè)。用HPLC色譜儀檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溫度對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響

提取時(shí)間為2.0h、甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%，考察提取溫度對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 提取溫度對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響Tab.1 The effect of extraction temperature on determination of soybean isoflavones

由表1可以看出：隨著提取溫度的升高，檢測(cè)出的大豆異黃酮含量相應(yīng)升高，65℃時(shí)達(dá)到最高，到70℃時(shí)檢測(cè)出的含量反而下降。因此，選擇最佳提取溫度為65℃。

2.2 提取時(shí)間對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響

提取溫度為65℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%，考察提取時(shí)間對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 提取時(shí)間對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響Tab.2 The effect of extraction time on determination of soybean isoflavones

由表2可以看出：隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)出的大豆異黃酮含量相應(yīng)升高，但是2.0h之后，含量的升幅不明顯。從經(jīng)濟(jì)和能源角度綜合考慮，選擇最佳提取時(shí)間為2.0h。

2.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響

提取溫度為65℃、提取時(shí)間為2.0h，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大豆異黃酮含量檢測(cè)的影響Tab.3 The effect of methanol volume fraction on determination of soybean isoflavones

由表3可以看出：隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，檢測(cè)出的大豆異黃酮含量相應(yīng)升高，但是由于80%甲醇溶液的沸點(diǎn)為69～70℃，若使用更高體積分?jǐn)?shù)的甲醇來提取，甲醇會(huì)沸騰揮發(fā)，體積分?jǐn)?shù)改變而影響檢測(cè)結(jié)果。故選取最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.4 日間精密度

提取溫度為65℃、提取時(shí)間為2.0h、甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%，將提取后待檢測(cè)提取液避光冷藏保存，連續(xù)5d檢測(cè)大豆異黃酮含量，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果如表4所示。

表4 大豆異黃酮含量檢測(cè)的日間精密度Tab.4 The day to day precision of determination of soybean isoflovones

由表4可以看出，采用AOAC方法檢測(cè)大豆異黃酮含量日間精密度良好，穩(wěn)定性高，數(shù)據(jù)具有良好的可靠性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

6種大豆異黃酮的分離效果如圖1所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程如表5所示。

圖1 6種大豆異黃酮的分離效果Fig.1 The separation effect of six kinds of soybean isoflavones

由圖1可以看出，在設(shè)定的HPLC色譜條件下，6種大豆異黃酮保留時(shí)間適當(dāng)，分離效果良好。

由表5可以看出，6種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)良好，相關(guān)性高。

表5 6種大豆異黃酮的線性回歸方程Tab.5 The linear regression equation of six kinds of soybean isoflavones

3 結(jié)論

研究表明，AOAC方法通過提取、皂化和液相色譜檢測(cè)，能夠簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣品中大豆異黃酮的含量，其最佳提取溫度為65℃、最佳提取時(shí)間為2.0h、最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%。該方法在5d內(nèi)的日間精密度良好，穩(wěn)定性高。且AOAC方法中大豆異

黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好，可靠性高。只采用6種大豆異黃酮異構(gòu)體就可檢測(cè)出大豆異黃酮含量。AOAC方法操作簡(jiǎn)單、成本較低，對(duì)國(guó)內(nèi)大豆異黃酮的測(cè)定具有較好的參考意義。

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