王 玥，鄭啟城，姚秀云，鄧 兵，憲 瑩，于 潔

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地 400014）

HRM－非標(biāo)記探針法檢測(cè)IL－15基因SNPs方法的建立＊

王 玥，鄭啟城，姚秀云，鄧 兵，憲 瑩，于 潔△

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地 400014）

目的建立用于檢測(cè)白細(xì)胞介素－15（IL－15）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的高分辨率熔解曲線（HRM）－非標(biāo)記探針的方法。方法采用HRM－非標(biāo)記探針法及小片段擴(kuò)增法對(duì)80名健康兒童IL－15基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，采用基因測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證并同時(shí)與小片段擴(kuò)增法分型結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果HRM－非標(biāo)記探針法與基因測(cè)序分型結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為100%；未加入溫度內(nèi)標(biāo)的小片段擴(kuò)增法不能區(qū)分野生純合子和突變純和子。結(jié)論HRM－非標(biāo)記探針法是對(duì)已知SNP位點(diǎn)突變研究的一種廉價(jià)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的基因分型技術(shù)，適合于對(duì)已知的SNP位點(diǎn)或基因突變進(jìn)行分型和檢測(cè)。

白細(xì)胞介素15；多態(tài)性，單核苷酸；高分辨率熔解曲線分析；非標(biāo)記探針法

高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）分析技術(shù)是一種新的DNA突變檢測(cè)技術(shù)，其原理是通過摻入飽和熒光染料實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA雙鏈熔解過程的監(jiān)控，再利用Tm值的差異和熔解曲線的形狀來區(qū)別突變［1］。HRM屬于全閉管式操作，前期的PCR和后期的熔解曲線分析均在一個(gè)管內(nèi)完成，不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和處理。與單鏈構(gòu)象分析、高效液相色譜、變性梯度凝膠電泳、毛細(xì)管凝膠電泳等方法相比，HRM減少了交叉污染的概率并且節(jié)省了后期操作的成本和時(shí)間。此外，由于HRM不對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切等操作，不影響產(chǎn)物完整性，因此分析后的樣品能夠繼續(xù)用于后續(xù)試驗(yàn)，如凝膠電泳、測(cè)序等，利用HRM技術(shù)進(jìn)行基因分型的常用方法有兩種:小片段擴(kuò)增法和非標(biāo)記探針法。目前，國(guó)內(nèi)較多報(bào)道是采用小片段擴(kuò)增法進(jìn)行基因突變的篩查和基因分型，其弱點(diǎn)是對(duì)野生純合子和突變純合子以及對(duì)G／C突變及A／T突變的區(qū)分能力較差，需要額外引入溫度內(nèi)標(biāo)或已知基因分型的樣品進(jìn)行區(qū)分［2］。而使用非標(biāo)記探針法直接針對(duì)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，能夠較好地區(qū)分野生純合子和突變純合子，尤其是G／C突變和A／T突變，故較適用于已知SNPs的基因分型，但目前在國(guó)內(nèi)應(yīng)用HRM－非標(biāo)記探針法進(jìn)行基因分型的研究報(bào)道較少。

白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率為3～5／10萬，占兒童惡性腫瘤的35%以上，其中又以急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）為主，占70%～80%；該病發(fā)病機(jī)制未完全闡明，并且在現(xiàn)行化療方案下仍有部分患兒無法獲得臨床緩解或者發(fā)生復(fù)發(fā)［3－4］。2003年，本院對(duì)193例ALL患兒治療情況進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)仍有9%無法達(dá)到臨床緩解；隨訪22例進(jìn)入維持治療期的患兒，其中4例復(fù)發(fā)［5］。因此，為進(jìn)一步提高ALL患兒的治愈率，應(yīng)繼續(xù)尋找與ALL治療不緩解以及復(fù)發(fā)相關(guān)的危險(xiǎn)因素。最近，一項(xiàng)基于全基因組范圍的SNPs篩查研究發(fā)現(xiàn)，位于IL－15 3′端非翻譯區(qū)（3′－UTR）的5個(gè)SNPs位點(diǎn)（rs17007695、rs35964658、rs10519613、rs10519612和rs17015014）與兒童ALL治療后微小殘留病陽(yáng)性密切相關(guān)［6－7］。為進(jìn)一步證實(shí)上述位點(diǎn)與中國(guó)白血病患兒發(fā)病及預(yù)后的相關(guān)性，本研究選取IL－15SNPs位點(diǎn)為研究對(duì)象，擬對(duì)IL－15SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，而其中關(guān)鍵的技術(shù)的是IL－15SNPs的基因型檢測(cè)。鑒于HRM技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，以及待分析的IL－15SNPs位點(diǎn)中包含C／G突變，因此本文選取了基于Light Scanner96HRM檢測(cè)儀的HRM－非標(biāo)記探針法，并應(yīng)用該方法首先對(duì)健康兒童的IL－15 3′－UTR單個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有80例樣本來源于既往本院進(jìn)行兒童流行病學(xué)調(diào)查時(shí)所凍存的健康體檢兒童外周血樣本。采用TIA Namp Genomic DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。

1.2 HRM 檢測(cè)

1.2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)和合成 在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入SNP識(shí)別號(hào)，獲取SNP位點(diǎn)前后250bp片段（參考序列 NC＿000004.11，IL－15范 圍:142，557，749－142，655，140）。利 用 Primer－Blast網(wǎng) 站 （http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primer－blast）設(shè)計(jì)高特異性引物，并將產(chǎn)物長(zhǎng)度限制在100～300bp。采用Oligo6軟件對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，剔除含有會(huì)影響擴(kuò)增效率的引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物對(duì)。設(shè)計(jì)非標(biāo)記探針與野生型互補(bǔ)，其3′末端采用 C－3spacer法封閉。rs17007695上游:5′－TGA GGC TAC GTC AGA GCT AGG CAT－3′，下游:5′－CCA CCT CGA GCC TGG TAC AAC A－3′，探針:5′－TAC CAT TGG CTT TCT TTG AAA ATC ACA CAT－3′（250bp）；rs35964658 上 游:5′－CCC TTA GCC CCC AGC AAT GAG C－3′，下游:5′－TGG AGA AGG TGT GGC TTA CCC C－3′，探 針:5′－TCA AAT GAC CAC ACT TTA ATT TTC CAG C－3′（297bp）；rs10519613上游:5′－GCA AAG AAT GTG AGG AAC TGG AG－3′，下游:5′－TGC CTT CAT TTC TAA GAG TTC ATC TG－3′，探針:5′－ACT CGG CAT TTC AAA TGT GCT GTC A－3（254bp）；rs17015014上游:5′－ACA CTG GGG CTG AAG CAC ATC T－3′，下 游:5′－AGC CAA CAC CCT CAT CCC TTT GC－3′，探針:5′－GAA GCA AGT TTG CTG TAA AGA TGC TA－3′（194bp）。引物和探針均由上海生生物工程有限公司合成。

1.2.2 不對(duì)稱PCR擴(kuò)增 使用 Mastercycler梯度聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（德國(guó)Eppendorf公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)用2×Hotstrat Taq PCR Master Mix試劑（北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行擴(kuò)增，熒光染料用高分辨率的飽和LC Green熒光染料試劑（美國(guó)Idaho公司）。反應(yīng)體系包括:DNA模板1 μL（1ng／μL），PCR Master Mix（2× ）5μL，上 游 引 物 （1 μmol）、下游引物（5μmol）各1μL，探針（2.5μmol）1μL，LC Green熒光染料（10×）染料1μL。PCR擴(kuò)增條件為:95℃ 預(yù)變性120s；然后95℃30s，63℃30s退火，72℃30s延伸，共55個(gè)循環(huán)以促進(jìn)引物的消耗，確保單鏈的大量合成；95℃60s，15℃停止，促進(jìn)異源雙鏈核酸分子形成。

1.2.3 HRM分析進(jìn)行基因分型 采用Light Scanner96HRM檢測(cè)儀（美國(guó)Idaho公司）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分型。檢測(cè)溫度范圍為60～85℃，每升高0.1℃采集1次熒光亮度數(shù)據(jù)。獲得原始熔解曲線圖后，Light Scanner96分析軟件即自動(dòng)對(duì)背景信號(hào)和孔間熒光信號(hào)進(jìn)行校正。選定探針峰熔解曲線范圍后，軟件生成標(biāo)準(zhǔn)化后的熔解曲線圖，并行自動(dòng)基因分型。

2 結(jié) 果

Light Scanner96HRM檢測(cè)儀一次掃描可對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行熔解曲線分析，每次分析用時(shí)約8min。60～85℃范圍內(nèi)共產(chǎn)生兩個(gè)熔解曲線峰，低溫區(qū)的為探針峰，高溫區(qū)的為產(chǎn)物峰。通過將分析范圍限制在探針峰區(qū)域并經(jīng)行轉(zhuǎn)換生成衍生圖后，純合子的熔解曲線為單峰、雜合子為雙峰。由于所有的非標(biāo)記探針設(shè)計(jì)與野生型互補(bǔ)，故野生型的Tm值高于突變型，Tm差值為3～6℃。根據(jù)探針峰的數(shù)目、峰型以及Tm值，采用Light Scanner軟件對(duì)樣本進(jìn)行自動(dòng)分型，見圖1。筆者采用非標(biāo)記探針法、小片段擴(kuò)增法及測(cè)序法對(duì)這80份健康漢族兒童標(biāo)本進(jìn)行了以上4個(gè)位點(diǎn)的測(cè)定。非標(biāo)記探針法分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為100%（表1）；另一方面，由于未加入高低溫內(nèi)標(biāo)，小片段擴(kuò)增法僅能夠區(qū)分雜合型和純合型，但對(duì)進(jìn)一步區(qū)分野生純合型和突變純合型的能力較差。rs17015014G＞C位點(diǎn)48個(gè)樣本的兩種分型方法結(jié)果，見圖2。

圖1 HRM－非標(biāo)記探針法的基因分型

圖2 非標(biāo)記探針法與小片段擴(kuò)增法分型比較

表1 80例樣本基因分型結(jié)果

2 討 論

HRM分析是近年來興起的SNPs篩查和基因分型的技術(shù)，并且因其高通量、高準(zhǔn)確性以及廉價(jià)的特點(diǎn)而受到了越來越多的關(guān)注和應(yīng)用［8－9］。常用的HRM分析法有小片段擴(kuò)增法和非標(biāo)記探針法。小片段擴(kuò)增法多被用于測(cè)序前的突變篩查，以減少測(cè)序的工作量。其缺點(diǎn)是在用于G／C突變（Ⅲ類突變）或A／T突變（Ⅳ類突變）的基因分型時(shí)，由于Tm值相差太小，往往不容易將野生純合子和突變純合子分開。在本實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)行了小片段擴(kuò)增法分析，但未能夠得到準(zhǔn)確的分型結(jié)果，考慮與所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大（194～297bp）以及未加入高低溫內(nèi)標(biāo)作孔間溫度校正有關(guān)。此外，高通量HRM檢測(cè)儀（96／384孔）由于存在孔間溫度差異問題，需要在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)都加入一對(duì)同樣經(jīng)過3′端封閉的高低溫內(nèi)標(biāo)進(jìn)行溫度校正，因此在費(fèi)用方面并不比非標(biāo)記探針法更低廉。

非標(biāo)記探針法基本原理同小片段擴(kuò)增法，都是通過比較Tm值差異進(jìn)行基因分型。但與小片段擴(kuò)增法比較產(chǎn)物的熔解曲線不同，非標(biāo)記探針法比較的是探針與產(chǎn)物的熔解曲線。由于加入的探針長(zhǎng)度較短（20～40bp），增加了的Tm值差距（＞3℃），因此非標(biāo)記探針法在區(qū)分G／C突變（Ⅲ類突變）和A／T突變（Ⅳ類突變）時(shí)更具有優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)涉及的4個(gè)SNP位點(diǎn)中即包含一個(gè)G／C突變。結(jié)果顯示非標(biāo)記探針法對(duì)該位點(diǎn)的區(qū)分清楚、分型準(zhǔn)確，以測(cè)序法為標(biāo)準(zhǔn)其準(zhǔn)確率可達(dá)100%。Liew等［10］對(duì)小片段擴(kuò)增法和非標(biāo)記探針法進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增片段小于100bp時(shí)，小片段擴(kuò)增法與非標(biāo)記擴(kuò)增法的分型結(jié)果一致，準(zhǔn)確率都能夠達(dá)到100%；但當(dāng)擴(kuò)增片段大于200bp時(shí)，由于小片段擴(kuò)增法中野生／突變純合子間的Tm值差異減小，從而導(dǎo)致了分型準(zhǔn)確性下降。另外，由于有研究提到了可以采用低分辨率的熒光定量PCR儀對(duì)非標(biāo)記探針進(jìn)行基因分型，因此，筆者也試圖利用Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，但結(jié)果未見熔解曲線中有明顯的探針峰，并且利用產(chǎn)物峰亦不能分型，考慮可能與機(jī)器激發(fā)光源和LCGreen染料不匹配和不能將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Light Scanner軟件進(jìn)行分析有關(guān)。

非標(biāo)記探針法中，探針設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。經(jīng)驗(yàn)表明，22bp以上的探針長(zhǎng)度能夠提供足夠強(qiáng)的探針峰熒光強(qiáng)度；探針Tm值最好在55～70℃，以避免與引物二聚體Tm范圍重疊（通常在75～80℃）及影響產(chǎn)物的擴(kuò)增。盡管通過以上方法已能夠?qū)Υ蟛糠諷NPs或基因突變進(jìn)行分型檢測(cè)，但更復(fù)雜的基因分型，比如基因突變合并單核苷酸多態(tài)性、相鄰位點(diǎn)的多個(gè)基因突變等，仍然給非標(biāo)記探針法帶來了挑戰(zhàn)。由于受到同一擴(kuò)增片段中的相鄰的突變位點(diǎn)或SNP位點(diǎn)的干擾，野生型和突變型的探針峰熔解曲線可能會(huì)很相似，因此無法順利進(jìn)行區(qū)分。Poulson等［11］以隔離－探針 PCR（iolated－probe PCR，IP－PCR）實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為基礎(chǔ)，通過設(shè)計(jì)兩個(gè)Tm值差距較大的非標(biāo)記探針成功地對(duì)同一擴(kuò)增片段中相隔46bp的兩個(gè)SNP位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行基因分型，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本；Margraf等［12］則是通過采用“遮蔽技術(shù)”，即將非標(biāo)記探針上的一個(gè)或多個(gè)突變／SNPs位點(diǎn)進(jìn)行遮蔽（錯(cuò)配法、位點(diǎn)刪除法或通用堿基法），排除了鄰近單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)或突變位點(diǎn)帶來的干擾，清楚的識(shí)別出了存在突變的樣本。這些方法的提出使非標(biāo)記探針法具有了對(duì)較復(fù)雜的突變／SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型的能力，拓寬了非標(biāo)記探針法的應(yīng)用范圍。

綜上所述，非標(biāo)記探針法在區(qū)別Ⅲ、Ⅳ類突變時(shí)較小片段擴(kuò)增法更具有優(yōu)勢(shì)、實(shí)驗(yàn)成本更低廉，更適合于對(duì)已知的SNPs位點(diǎn)或基因突變進(jìn)行分型和檢測(cè)。

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To establish the high resolution melting analysis with unlabeled probes for genotyping IL－15 gene SNPs＊

Wang Yue，Zheng Qicheng，Yao Xiuyun，Deng Bing，Xian Ying，Yu Jie△
（Department of Hematology－Oncology，the Affiliated Children＇s Hospital of Chongqing Medical University／the Key Laboratory of Child Development Disease Research of Education Ministry／the Key Laboratory of Paediatrics of Chongqing／Chongqing International Science and Technology Cooperation Base for Major Child Disease Development and Prevention，Chongqing400014，China）

ObjectiveWe were going to establish the high resolution melting analysis with unlabeled probes for genotyping IL－15gene SNP.MethodsGenotypes of the IL－15gene SNPs were determined in 80unrelated Han healthy children using High resolution melting curve analysis with unlabeled probes，small amplification method，genotype results were corroborated by gene sequencing.ResultsThe genotype result from unlabeled probes method and gene sequencing were consistent，the accuracy rate was 100%；small amplification method without temperature inter calibration could not differentiate the wild homozygous and mutant homozygous.ConclusionHigh resolution melting curve analysis with unlabeled probes is a cheap，convenient，fast and accurate genotype technology for known SNP sites.

interleukin－15；polymorphisms，single nucleotide；high resolution melting；unlabeled probes

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.001

A

1671－8348（2012）34－3577－03

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2007BAI04B03）；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目（2011－2－208）。 △

，Tel:13906005672；E－mail:yujie167＠yahoo.com。

2012－07－02

2012－09－18）