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        黑曲霉固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2012-07-30 10:33:30楊曉蘭任翠娟劉曉東
        養(yǎng)殖與飼料 2012年12期
        關(guān)鍵詞:三角瓶黃豆粉玉米粉

        楊曉蘭 任翠娟 易 卿 劉曉東 趙 潔

        1.河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心,河南 三門峽 472143;2.三門峽龍飛生物工程有限公司,河南 三門峽 472143

        黑曲霉屬子囊菌亞門絲孢目叢梗孢科,壁厚而光滑,頂部形成球形頂囊,其上覆蓋一層?;鸵粚有」?,小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀體(直徑2.5~4.0μm);分生孢子頭呈球狀,直徑700~800μm,褐黑色;蔓延迅速,初為白色,后變成鮮黃色直至呈黑色厚絨狀,背面無色或中央略帶黃褐色;分生孢子頭呈褐黑色、放射狀,分生孢子梗長(zhǎng)短不一;頂囊球形,雙層小梗;分生孢子為褐色、球形。廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中,是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種。

        利用微生物或生物產(chǎn)品來降解污染物的生物修復(fù)方法是目前消除和降解農(nóng)藥殘留的一種安全、有效、廉價(jià)的方法,與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法相比,具有無毒、無殘留、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。微生物主要通過其特有的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶將有機(jī)磷農(nóng)藥中的P-O、P-S、P-N等化學(xué)鍵裂解而實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的分解和利用。一種農(nóng)藥可以被多種微生物降解;同時(shí),一種微生物也可以分解多種有機(jī)磷農(nóng)藥。趙杰宏[1]研究表明,有機(jī)磷水解酶(OPH)能夠自發(fā)代謝有機(jī)磷農(nóng)藥,OPH能夠廣泛降解有機(jī)磷酸酯類組分的P-O、P-S、P-F和P-CN鍵,如對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、苯硫磷、毒死蜱、殺螟腈等。

        近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過富集培養(yǎng)、分離篩選等技術(shù),從土壤或污水中篩選出很多能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌群,包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等,其中以芽孢桿菌、蒼白桿菌、克雷伯氏菌等細(xì)菌為主,對(duì)有降解有機(jī)磷農(nóng)藥能力的真菌也有報(bào)道,但多以曲霉屬為主。由于真菌的生物量大,遺傳性狀穩(wěn)定,而且產(chǎn)孢子的真菌在自然條件下具有較強(qiáng)的生存能力,因此篩選具有高效降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥的真菌的研究已成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。王繼雯等[2]從有機(jī)磷農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤中分離獲得了一株高效黑曲霉降解菌,對(duì)其降解酶進(jìn)行了分離和純化,并對(duì)其酶學(xué)性進(jìn)行了研究,以期為篩選具有高效降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物的研究提供理論依據(jù)。黃福常等[3]對(duì)滅菌的黑曲霉發(fā)酵濾液殺線蟲作用進(jìn)行了研究,找到了經(jīng)濟(jì)有效的發(fā)酵濾液培養(yǎng)基(豆芽汁培養(yǎng)基),發(fā)現(xiàn)不同濃度、不同pH值的發(fā)酵濾液均能影響其殺線蟲效果。

        黑曲霉菌渣的資源化利用研究吸引了越來越多的研究者。如何灝彥等[4]利用黑曲霉菌絲體制備殼聚糖;孟雪嬌等[5]的研究結(jié)果表明,黑曲霉死菌粉劑所具有的多層纖維結(jié)構(gòu)可為吸附染料分子提供較大的比表面,對(duì)于直接耐曬翠藍(lán)染料的吸附處理,黑曲霉死菌粉劑與活性炭粉劑適宜的吸附條件為:酸性至弱堿性條件下,投加量為8g/L,黑曲霉死菌粉劑比活性炭粉劑的吸附速度快、脫色性能高、抗染料濃度負(fù)荷沖擊能力強(qiáng)。黑曲霉菌體殘?jiān)Y源化利用在技術(shù)領(lǐng)域具備可行的實(shí)踐途徑和案例,不僅能減輕環(huán)境污染,而且可實(shí)現(xiàn)變廢為寶,但高值化開發(fā)黑曲霉菌體殘?jiān)杂写M(jìn)一步研究探討。黑曲霉菌體殘?jiān)鳛轱暳咸砑游锢梅矫妫恍┯泻Φ挠袡C(jī)物成分還有待進(jìn)一步檢測(cè)[6]。

        1 材料與方法

        1.1 菌 種

        黑曲霉斜面試管,4℃冰箱保藏,由河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心保存。

        1.2 儀器與器皿

        試管,500mL三角瓶,250mL三角瓶,150mL三角瓶,高壓蒸汽滅菌鍋,萬級(jí)無菌室,搖床,吸量管,平皿,培養(yǎng)箱。

        1.3 菌種的處理

        察氏培養(yǎng)基的制備:硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、蒸餾水1 000mL,加熱溶解,分裝到500mL的三角瓶中,每瓶裝200mL,121℃高壓蒸汽滅菌30min,晾至35℃待用。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:固體培養(yǎng)基①包括麩皮70.0%、黃豆粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%;固體培養(yǎng)基②包括麩皮70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%;固體培養(yǎng)基③包括麩皮70.0%、米糠25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%;固體培養(yǎng)基④包括米糠70.0%、黃豆粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%;固體培養(yǎng)基⑤包括米糠70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%;固體培養(yǎng)基⑥包括米糠70.0%、麩皮25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%。

        菌種活化:先將黑曲霉的試管種純化后再用于試驗(yàn)。將一支黑曲霉斜面接種到已滅過菌的裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,在搖床中于30℃、200r/min培養(yǎng)2~3d。

        固體培養(yǎng)基①的處理:先將干的麩皮和黃豆粉按比例混合均勻,再將其他材料溶于800mL自來水中;用固體培養(yǎng)基①中的自來水拌濕拌勻麩皮黃豆粉;將混勻的物料于121℃滅菌60min,滅菌后物料含水量應(yīng)在55%~60%;待溫度降至接種溫度后,將培養(yǎng)好的黑曲霉液體種子(約60mL)接種到固體物料上,并攪拌均勻。

        其他固體培養(yǎng)基的處理同上。

        1.4 發(fā)酵條件

        固體發(fā)酵:要求在空氣流通、溫度25~34℃的水泥地面(消毒液浸泡過)上,將處理好的固體培養(yǎng)基鋪成約2cm厚(平鋪時(shí)宜使物料保持蓬松狀態(tài),不可拍打壓實(shí)),用報(bào)紙將物料覆蓋,發(fā)酵5~6d(發(fā)酵過程中不必翻攪),待黑色的菌絲或孢子囊大量形成時(shí)即發(fā)酵完成。

        1.5 測(cè)定方法

        采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法,具體操作方法:黑曲霉長(zhǎng)成以后,晾干、粉碎,稱取10g,放于裝有100 mL無菌水(高壓蒸汽滅菌)的225mL高壓蒸汽滅菌的三角瓶中,靜置20min,搖床搖30min;用5mL高壓蒸汽滅菌的吸量管吸取1∶10稀釋液5mL,沿管壁徐徐注入含有45mL無菌水的三角瓶?jī)?nèi),振搖三角瓶混合均勻,制成1∶100的稀釋液;另取5mL高壓蒸汽滅菌的吸量管,按上項(xiàng)操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋1次即換用1支5mL高壓蒸汽滅菌的吸量管;稀釋至合適倍數(shù),取高壓蒸汽滅菌的0.1mL吸量管吸0.1mL,注入裝有固體培養(yǎng)基的平皿中,作3個(gè)平行樣品,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng);培養(yǎng)24h后,計(jì)數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        黑曲霉不同固體發(fā)酵培養(yǎng)基菌活數(shù)及生長(zhǎng)情況見表1。

        表1 黑曲霉不同固體發(fā)酵培養(yǎng)基菌活數(shù)及生長(zhǎng)情況

        由表1可知,菌活數(shù)從大到小排列為:固體培養(yǎng)基②>固體培養(yǎng)基⑤>固體培養(yǎng)基①>固體培養(yǎng)基③=固體培養(yǎng)基⑥>固體培養(yǎng)基④。研究表明,在固體培養(yǎng)基②的發(fā)酵條件下,黑曲霉菌活數(shù)最大,固體培養(yǎng)基⑤次之。固體培養(yǎng)基④和固體培養(yǎng)基⑤染有雜菌因此都顯灰色,且固體培養(yǎng)基④染菌較固體培養(yǎng)基⑤嚴(yán)重;以麩皮作主料,黃豆粉、玉米粉與米糠3者相比,玉米粉影響最大;以米糠作主料,黃豆粉、玉米粉與麩皮3者相比,玉米粉影響最大。

        3 討 論

        以黑曲霉為研究對(duì)象,經(jīng)不同固體培養(yǎng)基發(fā)酵,以稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)黑曲霉的菌活數(shù),測(cè)得菌活數(shù)從大到小排列為:固體培養(yǎng)基②>固體培養(yǎng)基⑤>固體培養(yǎng)基①>固體培養(yǎng)基③=固體培養(yǎng)基⑥>固體培養(yǎng)基④。研究表明,在固體培養(yǎng)基②的發(fā)酵條件下,黑曲霉菌活數(shù)最大,固體培養(yǎng)基⑤次之。米糠與麩皮相比,麩皮作主要原料黑曲霉的菌活數(shù)更大;黃豆粉、玉米粉分別與米糠和麩皮相結(jié)合的各組合相比,玉米粉與麩皮的組合黑曲霉菌活數(shù)最大。麩皮較米糠粘性強(qiáng)、吸水性好、營(yíng)養(yǎng)更豐富,所以作為黑曲霉發(fā)酵主料更合適。試驗(yàn)表明,黑曲霉的優(yōu)化培養(yǎng)基是麩皮70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.1%。

        [1]趙杰宏.有機(jī)磷水解酶基因OPD轉(zhuǎn)化番茄、黃瓜降解農(nóng)藥殘留的研究[D].貴陽:貴州大學(xué),2010.

        [2]王繼雯,甄靜,謝寶恩,等.黑曲霉有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的純化及其性質(zhì)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,28(3):549-554.

        [3]黃福常,覃培升,韋春月.黑曲霉發(fā)酵濾液殺食用菌線蟲活性初探[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2008,27(4):439-444.

        [4]何灝彥,劉佳佳,于津津.利用黑曲霉菌絲體制備殼聚糖的研究[J].糧油加工,2009(5):127-129.

        [5]孟雪嬌,熊小京,黃藝海,等.黑曲霉死菌與活性炭對(duì)直接耐曬翠藍(lán)FBL的吸附性能[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2010,4(6):1317-1320.

        [6]陳秀龍,蔡冠杰,覃新導(dǎo),等.黑曲霉菌渣資源化再利用途徑分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,31(6):24-27.

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