楊曉蘭 任翠娟 易 卿 劉曉東 趙 潔

1.河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心，河南 三門峽 472143；2.三門峽龍飛生物工程有限公司，河南 三門峽 472143

黑曲霉屬子囊菌亞門絲孢目叢梗孢科，壁厚而光滑，頂部形成球形頂囊，其上覆蓋一層?；鸵粚有」?，小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀體（直徑2.5～4.0μm）；分生孢子頭呈球狀，直徑700～800μm，褐黑色；蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至呈黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色；分生孢子頭呈褐黑色、放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一；頂囊球形，雙層小梗；分生孢子為褐色、球形。廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種。

利用微生物或生物產(chǎn)品來降解污染物的生物修復(fù)方法是目前消除和降解農(nóng)藥殘留的一種安全、有效、廉價(jià)的方法，與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法相比，具有無毒、無殘留、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。微生物主要通過其特有的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶將有機(jī)磷農(nóng)藥中的P－O、P－S、P－N等化學(xué)鍵裂解而實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的分解和利用。一種農(nóng)藥可以被多種微生物降解；同時(shí)，一種微生物也可以分解多種有機(jī)磷農(nóng)藥。趙杰宏［1］研究表明，有機(jī)磷水解酶（OPH）能夠自發(fā)代謝有機(jī)磷農(nóng)藥，OPH能夠廣泛降解有機(jī)磷酸酯類組分的P－O、P－S、P－F和P－CN鍵，如對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、苯硫磷、毒死蜱、殺螟腈等。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過富集培養(yǎng)、分離篩選等技術(shù)，從土壤或污水中篩選出很多能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌群，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等，其中以芽孢桿菌、蒼白桿菌、克雷伯氏菌等細(xì)菌為主，對(duì)有降解有機(jī)磷農(nóng)藥能力的真菌也有報(bào)道，但多以曲霉屬為主。由于真菌的生物量大，遺傳性狀穩(wěn)定，而且產(chǎn)孢子的真菌在自然條件下具有較強(qiáng)的生存能力，因此篩選具有高效降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥的真菌的研究已成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。王繼雯等［2］從有機(jī)磷農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤中分離獲得了一株高效黑曲霉降解菌，對(duì)其降解酶進(jìn)行了分離和純化，并對(duì)其酶學(xué)性進(jìn)行了研究，以期為篩選具有高效降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物的研究提供理論依據(jù)。黃福常等［3］對(duì)滅菌的黑曲霉發(fā)酵濾液殺線蟲作用進(jìn)行了研究，找到了經(jīng)濟(jì)有效的發(fā)酵濾液培養(yǎng)基（豆芽汁培養(yǎng)基），發(fā)現(xiàn)不同濃度、不同pH值的發(fā)酵濾液均能影響其殺線蟲效果。

黑曲霉菌渣的資源化利用研究吸引了越來越多的研究者。如何灝彥等［4］利用黑曲霉菌絲體制備殼聚糖；孟雪嬌等［5］的研究結(jié)果表明，黑曲霉死菌粉劑所具有的多層纖維結(jié)構(gòu)可為吸附染料分子提供較大的比表面，對(duì)于直接耐曬翠藍(lán)染料的吸附處理，黑曲霉死菌粉劑與活性炭粉劑適宜的吸附條件為：酸性至弱堿性條件下，投加量為8g／L，黑曲霉死菌粉劑比活性炭粉劑的吸附速度快、脫色性能高、抗染料濃度負(fù)荷沖擊能力強(qiáng)。黑曲霉菌體殘?jiān)Y源化利用在技術(shù)領(lǐng)域具備可行的實(shí)踐途徑和案例，不僅能減輕環(huán)境污染，而且可實(shí)現(xiàn)變廢為寶，但高值化開發(fā)黑曲霉菌體殘?jiān)杂写M(jìn)一步研究探討。黑曲霉菌體殘?jiān)鳛轱暳咸砑游锢梅矫妫恍┯泻Φ挠袡C(jī)物成分還有待進(jìn)一步檢測(cè)［6］。

1 材料與方法

1.1 菌 種

黑曲霉斜面試管，4℃冰箱保藏，由河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 儀器與器皿

試管，500mL三角瓶，250mL三角瓶，150mL三角瓶，高壓蒸汽滅菌鍋，萬級(jí)無菌室，搖床，吸量管，平皿，培養(yǎng)箱。

1.3 菌種的處理

察氏培養(yǎng)基的制備：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、蒸餾水1 000mL，加熱溶解，分裝到500mL的三角瓶中，每瓶裝200mL，121℃高壓蒸汽滅菌30min，晾至35℃待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基①包括麩皮70.0%、黃豆粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%；固體培養(yǎng)基②包括麩皮70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%；固體培養(yǎng)基③包括麩皮70.0%、米糠25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%；固體培養(yǎng)基④包括米糠70.0%、黃豆粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%；固體培養(yǎng)基⑤包括米糠70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%；固體培養(yǎng)基⑥包括米糠70.0%、麩皮25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%和硫酸鎂0.1%。

菌種活化：先將黑曲霉的試管種純化后再用于試驗(yàn)。將一支黑曲霉斜面接種到已滅過菌的裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在搖床中于30℃、200r／min培養(yǎng)2～3d。

固體培養(yǎng)基①的處理：先將干的麩皮和黃豆粉按比例混合均勻，再將其他材料溶于800mL自來水中；用固體培養(yǎng)基①中的自來水拌濕拌勻麩皮黃豆粉；將混勻的物料于121℃滅菌60min，滅菌后物料含水量應(yīng)在55%～60%；待溫度降至接種溫度后，將培養(yǎng)好的黑曲霉液體種子（約60mL）接種到固體物料上，并攪拌均勻。

其他固體培養(yǎng)基的處理同上。

1.4 發(fā)酵條件

固體發(fā)酵：要求在空氣流通、溫度25～34℃的水泥地面（消毒液浸泡過）上，將處理好的固體培養(yǎng)基鋪成約2cm厚（平鋪時(shí)宜使物料保持蓬松狀態(tài)，不可拍打壓實(shí)），用報(bào)紙將物料覆蓋，發(fā)酵5～6d（發(fā)酵過程中不必翻攪），待黑色的菌絲或孢子囊大量形成時(shí)即發(fā)酵完成。

1.5 測(cè)定方法

采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法，具體操作方法：黑曲霉長(zhǎng)成以后，晾干、粉碎，稱取10g，放于裝有100 mL無菌水（高壓蒸汽滅菌）的225mL高壓蒸汽滅菌的三角瓶中，靜置20min，搖床搖30min；用5mL高壓蒸汽滅菌的吸量管吸取1∶10稀釋液5mL，沿管壁徐徐注入含有45mL無菌水的三角瓶?jī)?nèi)，振搖三角瓶混合均勻，制成1∶100的稀釋液；另取5mL高壓蒸汽滅菌的吸量管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋1次即換用1支5mL高壓蒸汽滅菌的吸量管；稀釋至合適倍數(shù)，取高壓蒸汽滅菌的0.1mL吸量管吸0.1mL，注入裝有固體培養(yǎng)基的平皿中，作3個(gè)平行樣品，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

黑曲霉不同固體發(fā)酵培養(yǎng)基菌活數(shù)及生長(zhǎng)情況見表1。

表1 黑曲霉不同固體發(fā)酵培養(yǎng)基菌活數(shù)及生長(zhǎng)情況

由表1可知，菌活數(shù)從大到小排列為：固體培養(yǎng)基②＞固體培養(yǎng)基⑤＞固體培養(yǎng)基①＞固體培養(yǎng)基③＝固體培養(yǎng)基⑥＞固體培養(yǎng)基④。研究表明，在固體培養(yǎng)基②的發(fā)酵條件下，黑曲霉菌活數(shù)最大，固體培養(yǎng)基⑤次之。固體培養(yǎng)基④和固體培養(yǎng)基⑤染有雜菌因此都顯灰色，且固體培養(yǎng)基④染菌較固體培養(yǎng)基⑤嚴(yán)重；以麩皮作主料，黃豆粉、玉米粉與米糠3者相比，玉米粉影響最大；以米糠作主料，黃豆粉、玉米粉與麩皮3者相比，玉米粉影響最大。

3 討 論

以黑曲霉為研究對(duì)象，經(jīng)不同固體培養(yǎng)基發(fā)酵，以稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)黑曲霉的菌活數(shù)，測(cè)得菌活數(shù)從大到小排列為：固體培養(yǎng)基②＞固體培養(yǎng)基⑤＞固體培養(yǎng)基①＞固體培養(yǎng)基③＝固體培養(yǎng)基⑥＞固體培養(yǎng)基④。研究表明，在固體培養(yǎng)基②的發(fā)酵條件下，黑曲霉菌活數(shù)最大，固體培養(yǎng)基⑤次之。米糠與麩皮相比，麩皮作主要原料黑曲霉的菌活數(shù)更大；黃豆粉、玉米粉分別與米糠和麩皮相結(jié)合的各組合相比，玉米粉與麩皮的組合黑曲霉菌活數(shù)最大。麩皮較米糠粘性強(qiáng)、吸水性好、營(yíng)養(yǎng)更豐富，所以作為黑曲霉發(fā)酵主料更合適。試驗(yàn)表明，黑曲霉的優(yōu)化培養(yǎng)基是麩皮70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.1%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.1%。

［1］趙杰宏.有機(jī)磷水解酶基因OPD轉(zhuǎn)化番茄、黃瓜降解農(nóng)藥殘留的研究［D］.貴陽：貴州大學(xué)，2010.

［2］王繼雯，甄靜，謝寶恩，等.黑曲霉有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的純化及其性質(zhì)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：549－554.

［3］黃福常，覃培升，韋春月.黑曲霉發(fā)酵濾液殺食用菌線蟲活性初探［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2008，27（4）：439－444.

［4］何灝彥，劉佳佳，于津津.利用黑曲霉菌絲體制備殼聚糖的研究［J］.糧油加工，2009（5）：127－129.

［5］孟雪嬌，熊小京，黃藝海，等.黑曲霉死菌與活性炭對(duì)直接耐曬翠藍(lán)FBL的吸附性能［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2010，4（6）：1317－1320.

［6］陳秀龍，蔡冠杰，覃新導(dǎo)，等.黑曲霉菌渣資源化再利用途徑分析［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，31（6）：24－27.