付政祺 楊 瑩 田 青

1 江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北省武漢市 430056； 2 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系

借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使得不同大小、不同密度的物質(zhì)進行分離的技術(shù)，稱之為離心分離（centrifugation）［1］，它被廣泛應(yīng)用于細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離等。隨著超速離心機的問世，離心技術(shù)不再被簡單地用于較大顆粒的粗略分離，細胞器的分離、純化技術(shù)得以建立，使得對各細胞器特有化學(xué)組成、功能的研究變成可能。本文主要針對超速離心提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的方法及質(zhì)量控制進行詳細介紹。離心分離的基本方法，包括差速離心（differential centrifugation）和密度梯度離心（density gradient centrifugation）［2］。差速離心是指在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速對大小不同的細胞和細胞器進行逐級離心。但由于各種細胞器在大小和密度上的相互重疊，以及某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，使得細胞器的分離需要重復(fù)多次。因此，差速離心主要用于細胞器的初篩或分離大小、密度懸殊較大的細胞。密度梯度離心是指用一定的介質(zhì)（氯化銫、蔗糖等）在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將不同密度細胞的混懸液或經(jīng)勻漿破膜的細胞混懸液置于介質(zhì)的頂部，通過足夠大的離心力、足夠長時間，使得不同密度的細胞或細胞器沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將其進行分層、分離。分離活細胞的介質(zhì)除了要對細胞無毒外，并需能產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿芏忍荻?，且黏度不高、滲透壓不大，pH中性或易調(diào)為中性，以防止引起細胞和細胞器的水腫或塌陷，影響細胞或細胞器的提取及其質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞。本實驗所用細胞為野生型人胚胎腎細胞瘤細胞（wild type Human Embryonic Kidney 293，HEK293／wt）由許華曦博士（Rockeller University，NY，USA）提供［3］。

1.1.2 主要儀器。電動勻漿器（Glas－Col，美國），超聲儀（Sonics＆ Materials inc，美國），TP－200振蕩器，低溫高速離心機（日立），臺式高速離心機（Sigma），DG－C型電泳儀（東方特力科貿(mào)中心），轉(zhuǎn)膜儀（Bio－Rad，北京市六一儀器廠），垂直型電泳槽和濕式電轉(zhuǎn)膜槽（Hoefer，美國），恒溫水浴箱（武漢科學(xué)儀器廠），4℃恒溫振蕩搖床（武漢科學(xué)儀器廠），圖像分析系統(tǒng)（Image pro－pluskodak，美國），Himac CS 150GX超速離心機（Hitachi，Tokyo，Japan）。

1.1.3 主要試劑。Bip／GRP78購自Abcam公司。羊抗兔過氧物酶結(jié)合二抗、羊抗鼠過氧物酶結(jié)合二抗、增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液、過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）和二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒均從Pierce公司購買。丙烯酰胺／N，N－二甲基甲叉雙丙烯酰（Acrylamide／Bis－Acrylamide，Acr／Bis）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecylsulpHate，SDS）、甘氨酸（Glycine，Gly）、小牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、三羥甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane，Tris）、脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，DOC）、Tris、礬酸鈉（Na3VO4）、β－磷酸甘油 （β－PG）、氟化鈉（NaF）、苯甲磺酰氟（pHenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、胰蛋白酶抑制劑（aprotinin）、亮肽酶（leupeptin）、胃蛋白酶抑制（pepstatin）、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）和尿酸（uric acid）均購自Sigma公司（St Louis，MO，USA）。DMEM 和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）從Gibico公司購買。免疫印跡所用抗體稀釋液為含0.02%NaN3的3%牛血清蛋白（BSA）。硝酸纖維素膜（nitrocellulose，NC）為Hybond公司產(chǎn)品。醋酸鈉、冰醋酸、氫氧化鈉、氯化鈉、蔗糖、高氯酸、硼酸和二甲基甲酰胺均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)。HEK293／wt細胞培養(yǎng)基為DMEM 和10%FBS［4，5］。DMED用Zeiss濾器真空負壓過濾除菌，F(xiàn)BS分裝成20ml／瓶，－20℃保存。細胞在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3d更換培養(yǎng)液1次，細胞達約70%～80%豐度時，傳代或用于實驗。

圖1 運用蔗糖離心技術(shù)提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

1.2.2 蔗糖梯度離心提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［6～8］。（1）收集細胞。用1×PBS收集細胞，離心3 000×g，2min，去上清。（2）將收集到的細胞破膜。①將收集到的細胞中加入勻漿液0.5ml，混勻。［勻漿液配方：0.25M 蔗糖，10mM Tris－HCI（pH7.4），1mM 醋酸鎂，PMSF0.174mg／L蛋白酶抑制劑］；②手動勻漿器勻漿30～60下。（3）將破膜的細胞加入到已建立好蔗糖密度梯度的離心管上。蔗糖密度梯度的建立：由下至上，2M 蔗糖0.2ml，1.3M 蔗糖0.8ml，1.16M 蔗糖0.7ml，0.8M 蔗糖0.4ml。且可以根據(jù)具體離心管的大小，按比例增加／減少各層次不同濃度的蔗糖體積。加入時，沿管壁緩慢加入，也可以將中號槍頭套在大槍頭外緩慢加入，以減少沖擊力，依次建立蔗糖密度梯度。（4）離心100 000×g，3h。（5）將離心管中的液體由上至下、輕柔地分12次等體積取出，分別加入到12個EP管中，做好標(biāo)記。（6）準(zhǔn)備樣品。將取出的12層液體加入1／3體積的4×buffer，煮10min，超聲，加入β巰基乙醇和溴芬蘭煮10min。（7）Western blot［9，10］。將依次取出的12管液體等體積上樣。孵育一抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性抗體Bip／GRP78，顯色。

2 結(jié)果

運用蔗糖梯度離心技術(shù)從HEK293／wt細胞（不含tau蛋白）中提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。選用桿狀玻璃勻漿器手動勻漿法破膜后，將破膜細胞加入到已建立好的蔗糖密度梯度上，離心100 000×g，不同時間，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所在層面。離心2h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分散于蔗糖梯度的不同層面（8～12層），特別是5～7層（圖1）。因為此處介質(zhì)密度較低，無法確定處于此處的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是破膜所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片；還是離心力場不夠，使得完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未沉降、平衡到與自身密度相等的介質(zhì)中。延長離心時間到3h發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集于10、11和12層（圖2）。

圖2 通過調(diào)整離心時間、利用蔗糖梯度離心技術(shù)提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在提取過程中質(zhì)量控制的關(guān)鍵因素有以下幾種。

3.1 恰當(dāng)?shù)钠颇し椒ê蛷姸仁浅晒μ崛〖毎鳎▋?nèi)質(zhì)網(wǎng)）的關(guān)鍵 目前，用于破碎細胞的方法主要有桿狀玻璃勻漿器手動勻漿法、電動勻漿器勻漿法、超聲波處理法、化學(xué)裂解法和反復(fù)凍融法。其中，桿狀玻璃勻漿器手動勻漿法和電動勻漿器勻漿法為細胞破膜提取細胞器的首選。但操作時須注意，由于旋轉(zhuǎn)、與接觸器皿摩擦產(chǎn)熱可導(dǎo)致細胞或細胞器中活性物質(zhì)的降解，因此勻漿時須用冷卻水降溫。超聲波發(fā)生器可經(jīng)其較強的沖擊和振動產(chǎn)生的剪力致使細胞破碎，但由于其作用力較強，除了打破細胞膜外，也易將各細胞器打碎。且超聲時大量產(chǎn)熱，生物大分子如核酸和酶對超聲敏感，一般不宜采用?；瘜W(xué)裂解法是在細胞懸液中加入 Triton－100、NP－40、SDS、去氧膽酸鈉使細胞裂解，此方法對細胞內(nèi)環(huán)境破壞較為嚴重，且往往仍須機械輔助破膜，一般不宜采用。反復(fù)凍融法，細胞經(jīng)反復(fù)多次凍融周期（－70℃或液氮冷凍，37℃融化）不適合用于提取細胞器。

3.2 適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)、離心力和離心時間是提取高濃度、高質(zhì)量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)鍵 本方法所采用的蔗糖密度梯度離心是首先利用介質(zhì)（蔗糖）建立合適的不同濃度的介質(zhì)密度（介質(zhì)的最高密度大于被分離組分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的密度）。通過足夠大離心力和足夠長時間，使得細胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）在連續(xù)梯度的蔗糖介質(zhì)中沉降，漂浮并停留到與自身密度相等的介質(zhì)處并停留達到平衡，從而將其進行分離提純。因此，離心力和離心時間的選擇尤為重要。此方法所需要的力場較大，往往需要使用超速離心，且離心的時間也較長。離心力和離心時間不夠會使得被分離細胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）不足以沉降、平衡到與自身密度相等的介質(zhì)中，而分散分布于密度低于自身密度的介質(zhì)中（圖1）。但過大的離心力、過長的離心時間又對細胞、細胞器不利。因此，選擇適當(dāng)?shù)碾x心力和離心時間是提取高濃度、高質(zhì)量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)鍵。

總之，蔗糖梯度離心提取細胞器的技術(shù)還處在不斷完善的過程中。在實際工作中我們要不斷總結(jié)經(jīng)驗，改進技術(shù)，降低破膜方法、提取方法和環(huán)境對細胞器的損傷，從而提取高濃度、高質(zhì)量的細胞器，拓寬細胞器提取、活體培養(yǎng)的應(yīng)用范圍。

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