高瑾英

(河北省石家莊市第一中學(xué) 050000)

人教版高中生物學(xué)教材必修2中有關(guān)DNA半保留復(fù)制證據(jù)的實(shí)驗(yàn)是難度較大的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，本文對(duì)其中的一些疑難點(diǎn)進(jìn)行分析，希望對(duì)教師講授此實(shí)驗(yàn)有所幫助。

1 什么是密度梯度離心

最先提出密度梯度離心概念的是Meselson。密度梯度離心就是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，再通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使樣品分層、分離。又可分為速度區(qū)帶離心和等密度梯度離心。Meselson和Stahl證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)利用的是等密度梯度離心。

等密度梯度離心又稱為平衡密度梯度離心，被分離的物質(zhì)依靠其各自的密度不同而分離。氯化銫(CsCl)是最常用的離心介質(zhì)，因?yàn)?mol/L的氯化銫溶液密度約1.7g/mL，與DNA密度最接近。在高速離心(30000～50000r/min)48～72h后，重金屬鹽的沉降作用與擴(kuò)散作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，氯化銫離心形成1.65～1.75g/mL的密度梯度。氯化銫密度梯度離心分離DNA原理是： 不同密度的DNA(14N、15N)在離心液中進(jìn)入與自身密度最接近的區(qū)域，從而將微小差異的DNA很明顯地區(qū)分開(kāi)。

2 為什么實(shí)驗(yàn)要從獲得15N-DNA做起

為什么實(shí)驗(yàn)要從獲得15N-DNA做起，而不是直接將含14N-DNA的大腸桿菌放在15N培養(yǎng)基中逐代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)？這是因?yàn)樵谝欢ǖ呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌后，要確定提取出的DNA經(jīng)密度梯度離心得到的究竟是哪種類(lèi)型的DNA，必須進(jìn)行比對(duì)。因此，首先要得到15N-DNA，方法是在15N培養(yǎng)基中將大腸桿菌培養(yǎng)多代后提取其DNA。然后將15N-DNA和14N-DNA進(jìn)行密度梯度離心，得到它們?cè)陔x心管中的位置，以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參照。結(jié)果表明，15N-DNA顯示為一條重密度帶位于離心管靠近管底的位置，而14N-DNA顯示為一條輕密度帶位于離心管靠近管口的位置。將含15N-DNA的大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N標(biāo)記培養(yǎng)基中，在不同的時(shí)間取出樣品，以一定手段裂解得到DNA，然后進(jìn)行密度梯度離心，與前兩組結(jié)果比對(duì)，即可判定得到的DNA種類(lèi)。

3 將15N標(biāo)記的大腸桿菌放在14N普通培養(yǎng)液后為什么要顯示培養(yǎng)兩代的結(jié)果

Watson和Crick提出了DNA半保留復(fù)制的假說(shuō)后，不乏質(zhì)疑。有人提出另外的假說(shuō)： 即全保留復(fù)制和分散復(fù)制(也稱彌散復(fù)制)。全保留復(fù)制模型認(rèn)為： 在DNA復(fù)制時(shí)，DNA并不需要解鏈，復(fù)制后新的DNA分子單鏈結(jié)合在一起，親代分子保持完整；分散復(fù)制認(rèn)為： 在復(fù)制過(guò)程中親代DNA雙鏈被切割成小片段，分散在新合成的兩個(gè)DNA分子中(圖1)。

圖1 DNA分子復(fù)制模型[1]

分析一代實(shí)驗(yàn)的結(jié)果： 子一代如果出現(xiàn)輕帶和重帶兩個(gè)條帶，則可斷定是全保留復(fù)制；但如果只有中密度帶，很可能是半保留復(fù)制，但也排除不了分散復(fù)制的可能，這樣就無(wú)法作出判斷。當(dāng)只有中密度帶時(shí)，再培養(yǎng)一代，如出現(xiàn)一條輕密度帶，一條中密度帶，則可確定為半保留復(fù)制；如無(wú)輕密度帶出現(xiàn)，則可確定為分散復(fù)制。可見(jiàn)，在14N培養(yǎng)液中至少培養(yǎng)兩代，才能以充足的證據(jù)證明DNA 復(fù)制的方式為半保留復(fù)制。當(dāng)然，將第一代全位于中帶的DNA 進(jìn)行熱變性和梯度離心，也能區(qū)分是半保留還是分散復(fù)制，如果僅得到中帶，則是分散復(fù)制; 若一半中帶、一半重帶，則是半保留復(fù)制。事實(shí)上，Meselson 和Stahl 不僅做了雙鏈DNA 的多代實(shí)驗(yàn)，而且也做了熱變性后梯度離心的實(shí)驗(yàn)。

4 Meselson和Stahl測(cè)定DNA條帶位置的手段是什么

同位素分為放射性同位素和穩(wěn)定性同位素兩類(lèi)。15N是穩(wěn)定性同位素，不具有放射性。兩位科學(xué)家利用的是15N和14N質(zhì)量的不同，含15N和14N的DNA可處在不同的CsCl密度位置。因此，本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)手段不是放射性同位素示蹤。DNA分子吸收紫外線，所以用一光源系統(tǒng)照射離心管，在照相底板上記錄DNA帶的位置[2]，其黑度可表示DNA的相對(duì)含量。

5 證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)是否運(yùn)用了假說(shuō)演繹法

該實(shí)驗(yàn)確實(shí)運(yùn)用了假說(shuō)演繹法。但是，提出假說(shuō)的是Watson和Crick(1950年)。提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，特定的堿基配對(duì)性質(zhì)讓他們立刻注意到遺傳物質(zhì)可能的復(fù)制機(jī)制，于是大膽地預(yù)測(cè)DNA復(fù)制可能采取的是一種半保留的方式。而Meselson和Stahl則設(shè)計(jì)了以大腸桿菌為材料的密度梯度離心實(shí)驗(yàn)，并預(yù)測(cè)假如為半保留復(fù)制，子一代出現(xiàn)的密度帶應(yīng)全部為中帶，子二代則應(yīng)出現(xiàn)中帶和輕帶兩種條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果果真如此?？梢?jiàn)，半保留復(fù)制是由Watson和Crick提出問(wèn)題和假說(shuō)，1957年由Meselson和Stahl演繹推理并驗(yàn)證了該假說(shuō)。